Методи хроматографії

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Методи хроматографії

(1 Голосувати)
pic1 3.1.2
Рис 1. Хроматографічні способи та методи розділення

Хроматографічне розділення білків – метод, який потребує менше часу в порівнянні з 2DE під час протеомних досліджень. Хроматографія – це процес розділення суміші речовин на окремі компоненти за допомогою системи, що складається з двох фаз, які, в свою чергу, не змішуються між собою. До методів хроматографічного розділення білків, що застосовуються в сучасній клінічній протеоміці, також належать методи рідинної хроматографії ( Liquid Chromatography, LC) (Рис. 1). Серед них:

· високоефективна рідинна хроматографія (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC), або нанорідинна хроматографія (nano Liquid Chromatography, nanoLC):

1) рідинна хроматографія з оберненою фазою (Reversed Phase Liquid Chromatography, RP-LC);
2) сильна катіон-обмінна рідинна хроматографія (Strong Cation-Exchange Liquid Chromatography, SCX-LC);
3) рідинна хроматографія на основі властивості витіснення за розміром молекул (Size Exclusion Chromatography - Liquid Chromatography, SEC-LC);
4) рідинна хроматографія на основі гідрофільних взаємодій (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, HILIC);
5) рідинна хроматографія, що базується на розділенні за ізоелектричною точкою (Isoelectric Focusing, IEF-LC);

  • двовимірна рідинна хроматографія (Two Dimensional Liquid Chromatography, 2D-LC);
  • багатовимірна рідинна хроматографія (Multidimensional Liquid Chromatography, MD-LC);
  • методи афінної хроматографії:

1) метод ізотоп-кодованих афінних міток (Isotope-coded affinity tags ICAT);
2) метод з використанням ізобарного тегу для відносної та абсолютної квантифікації (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification, iTRAQ);
3) іммобілізована метал-афінна хроматографія (Immobilized metal affinity chromatography, IMAC);

· стабільне ізотопне маркування на основі амінокислот у клітинній культурі (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC);

  • методи гель-хроматографії:

1) гель-фільтруюча;
2) гель-проникаюча.

pic2 3.1.2

Рис 2. Спрощена схема процесу в хроматографічній
колонці Адаптовано із [20]

HPLC або nanoLC – високоефективна рідинна хроматографія – базовий метод, який широко застосовується у поєднанні з більшістю технічних рішень для протеомних досліджень з метою ідентифікації та кількісного визначення тисяч білків у біологічних зразках. Принцип технології полягає в розділенні компонентів дослідної фракції завдяки різноманітним хімічним взаємодіям між пептидами і колонкою, що заповнена функціональною фазою, через яку пропускають об’єм дослідних зразків (Малюнок 2). Білкову суміш попередньо розщеплюють (наприклад, трипсинізують), поєднують з буфером (сумісним до певного типу колонки), «прив’язують» до колонки, а потім вимивають з неї відповідними градієнтами елюювання із швидкістю потоку в діапазоні від нл/хв до мкл/хв, що забезпечує використання мінімальної кількості дослідного препарату з більш високою чутливістю розділення.

Задля подальшого аналізу білків за допомогою MS і з використанням відповідних БД, фракціонування може проводитися як на відокремленій системі LC, так із застосуванням MD-LC – багатовимірної рідинної хроматографії, що поєднує в собі дві (2D-LC) і більше колонок для ортогонального розділення пептидних гідролізатів. Біологічні дослідні зразки містять тисячі білків, що можуть за чисельністю варіювати до п’яти порядків [1]. Білок, розщеплений за допомогою протеаз, у зв’язку з властивостями конформаційної будови, розподіляється на декілька пептидних продуктів [2], що ускладнює аналіз зразка від моменту протеолізу. Саме тому постає проблема про вирішення обмеженої пікової потужності деяких методів хроматографії, тобто більш точного диференціювання складних піків (піки різних речовин, які зливаються в один комплексний на хроматограмі).

Для покращення роздільної здатності використовується багатовимірне розділення MD-LC. Метод поєднує в собі декілька ортогональних методів розділення білків із використанням вимірювань, які базуються на різних молекулярних властивостях. До таких технічних рішень у межах хроматографічного розділення MD-LC належать:

  • RP – для багатовимірної рідинної хроматографії використовується мікрокапілярна колонка з оберненою фазою розділення пептидів [3]. В основі платформи лежить фізико-хімічна властивість гідрофобних взаємодій між колонкою і пептидами, а для елювання катіону використовують градієнт солі. Порядок елювання компонентів білкової суміші залежить від гідрофобності, заряду поверхні молекули та конформації основного і бокового ланцюгів білка.
  • SCX – використовується сильна катіон-обмінна колонка для багатовимірної хроматографії. В основі платформи лежить фізико-хімічна властивість розподіляти пептиди за їх амінокислотним складом [4].

SEC – для багатовимірної хроматографії використовується колонка з властивістю, що витісняє пептиди. В основі платформи лежить фізико-хімічна властивість витісняти пептиди за розміром [5].

HILIC – для багатовимірної рідинної хроматографії використовується колонка з гідрофільними взаємодіями між пептидами і колонкою [6].

IEF – для багатовимірної рідинної хроматографії використовується колонка з ізоелектричним фокусуванням пептидів. В основі платформи лежить фізико-хімічна властивість розділяти білки за їх ізоелектричною точкою [7,8].

Підхід 2D-LC найчастіше використовується для розділення пептидів під час першого елювання зразка з колонки SCX та другого елювання зразка з колонки RP, що дозволяє розділити пептиди за гідрофобністю, розчиненим зарядом та амінокислотним складом за один цикл роботи хроматографа (метод SCX-RP-LC) [9].

Афінна хроматографія – частина багатоступінчатої системи фракціонування рідинної хроматографії. Білки-регулятори присутні в клітині в дуже низьких концентраціях. Також динамічна природа і низька стехіометрія післятрансляційно модифікованих білків (наприклад, внаслідок фосфорилювання) унеможливлюють аналіз пептидів без їхнього попереднього збагачення. Афінні матеріали дозволяють збагачувати білки і пептиди до рівня, якого вимагають методи мас-спектрометрії. Метод афінної хроматографії також дозволяє очистити макромолекули білків, використовуючи їх індивідуальну високоспецифічну спорідненість до іншої молекули, яка, в свою чергу, приєднана до нерухомої фази. Такі молекули-пастки здатні лише на природні взаємодії з білками, але не змінюють їх конформацію під час приєднання. Існує чимало методів афінного очищення та збагачення білків. Зупинимося на деяких з них: ICAT та IMAC.

ICAT . Для виконання методу ізотоп-кодованих афінних міток спочатку виділяють з матеріалу білкову фракцію, поділяють її на дві частини для кожного з дослідних зразків. Першу частину дослідних зразків мітять легкими (8 атомів водню), а другу частину – тяжкими (8 атомів дейтерію) ізотопними реагентами. В обидва варіанти зразків додають також біотин-афінну мітку і тіольну реакційну групу для ковалентної взаємодії з цистеїном в межах білків. Далі обидва варіанти кожного зразка змішують. Після нанесення міток білки трипсинізують і отримані пептидні гідролізати наносять на колонки з реагентами (наприклад, авідином – авідин-афінне фракціонування) для збагачення ICAT-мічених форм. Отримані мічені препарати розділяють з використанням інших методів LC (наприклад, RP-LC), після чого аналізують на під’єднаному мас-спектрометрі [10]. Спектральний аналіз піка в одиночному режимі мас-спектрометра пептидів мічених ізотопами з двох різних джерел дозволяє оцінити відносну кількість пептиду, а отже, рівень білка. Далі пептидну суміш аналізують за допомогою тандемної мас-спектрометрії (MS/MS).

Недолік методу ICAT полягає в тому, що ізотопна мітка використовується лише для цистеїнвмісних пептидів, тобто приблизно 10% білків залишаються не визначеними в експерименті.

Перевагою методу ICAT в поєднанні з рідинною хроматографією і мас-спектрометрією є перспективні дослідження менш розчинних білків.

IMAC – імобілізована метал-афінна хроматографія – один з інструментів для селективного збагачення білків, що використовується в фосфопротеоміці для ідентифікації і кількісного визначення фосфорильованих білків і сайтів фосфорилювання післятрансляційних модифікацій. Іммобілізуюча метал-афінна хроматографія забезпечує збагачення білків завдяки хелатуючим властивостям деяких металів по відношенню до фосфатної групи фосфорильованих пептидів. Доступні координаційні центри позитивно заряджених іонів взаємодіють із негативно зарядженими групами фосфату і карбоксильними фрагментами.

Біологічні зразки для IMAC поєднують із сольовим буферним розчином, що має певний рН, перемішують, активують відповідними металовмісними речовинами і наносять на колонки для фракціонування або ж – на точки масиву 96-лункового біопроцесора для аналізу за допомогою відповідних білкових мас-рідерів. У ході роботи використовують афінні смоли у вигляді оксидів металів (TiO2 [11], Fe3O4 [12.], ZrO2 [13]), сульфатів металів (NiSO4 [14]), металічні ентеросорбенти (імінодиоцтова кислота, нітрилотриоцтова кислота), зв’язані з колонкою, та іммобілізовані іони металів (Fe3+ [15], Zr4+ [16], Ga3+ [17]), що дає змогу покращити покриття і зв’язати фосфорильовані пептиди. Вибірковість і специфічність методу коригується за допомогою різних умов буфера: рН, концентрації солі [18], складу буфера і наявності миючих засобів [19]. Цю афінну платформу також використовують як другу стадію збагачення після сильної катіон-обмінної хроматографії (метод SCX-IMAC-LC).

Гель-хроматографію (гель-фільтруючу та гель-проникаючу) застосовують як допоміжні методи рідинної хроматографії для оцінки молекулярної маси білкових молекул. В їх основі лежить відсутність тяжіння між гелем (нерухомою фазою) та розчиненою речовиною (рухомою фазою). В ході процесу розчин дослідного зразка проходить через пористий гель, розділяючи компоненти зразка виключно за розміром. Менші молекули легше проходять крізь гель, довше затримуючись в середині фази. Саме тому їх шлях проходження через колонку довший у порівнянні з молекулами білків більших розмірів. Гель-проникаючу хроматографію часто застосовують перед виконанням методики MALDI MS.

Кожен з методів рідинної хроматографії знайшов своє застосування для профілювання різноманітних біологічних зразків до подальшої ідентифікації білків іншими технологіями. Так, в дослідженнях останніх років часто хроматограф поєднується з мас-спектрометром (метод LC–MS, Liquid chromatography–Mass Spectrometry), що сприяє отриманню нових відтворюваних наукових результатів. 

1. Gygi SP, Corthals GL, Zhang Y, Rochon Y, Aebersold R. (2000). Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis technology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9390–95
2. Wolters DA,Washburn MP, Yates JR 3rd. (2001). An automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics. Anal. Chem. 73:5683–90
3. Gilar, M.; Olivova, P.; Daly, A. E.; Gebler, J. C. (2005)/Two-dimensional separation of peptides using RP-RP-HPLC system with different pH in first and second separation dimensions. J. Sep. Sci. 28 (14): 1694−1703.
4. Link, A. J.; Eng, J.; Schieltz, D. M.; Carmack, E.; Mize, G. J.; Morris, D. R.; Garvik, B. M.; Yates, J. R. (1999). Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 17 (7): 676−682
5. Gilar, M.; Olivova, P.; Daly, A. E.; Gebler, J. C. (2005). Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal. Chem. 77 (19): 6426−6434
6. Boersema, P.; Mohammed, S.; Heck, A. (2008). Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) in proteomics. Anal. Bioanal. Chem., 391 (1): 151−159
7. O’Farrell, P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.
J. Biol. Chem. 250 (10): 4007−4021
8. Slebos, R. J. C.; Brock, J. W. C.; Winters, N. F.; Stuart, S. R.; Martinez, M. A.; Li, M.; Chambers, M. C.; Zimmerman, L. J.; Ham, A. J.; Tabb, D. L.; Liebler, D. C. (2008). Evaluation of strong cation exchange versus isoelectric focusing of peptides for multidimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Proteome Res., 7 (12): 5286−5294
9. Yang F., Shen Yu., Camp D. G., II, Smith R. D. (2012). High pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation as an alternative to strong-cation exchange chromatography for two-dimensional proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9(2): 129–134.
10. Gygi S. P., Rist B., Gerber S. A.,. Turecek F, Gelb M. H., and Aebersold R. (1999). Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat. Biotechnol. 17:994–999
11. Pinkse MW, Uitto PM, Hilhorst MJ, Ooms B, Heck AJ. (2004). Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal. Chem. 76:3935–43
12. Li Y, Xu X, Qi D, Deng C, Yang P, Zhang X. (2008). Novel Fe3O and TiO2 core-shell microspheres for selective enrichment of phosphopeptides in phosphoproteome analysis. J. Proteome Res. 7:2526–38
13. Zhou H, Tian R, Ye M, Xu S, Feng S, et al. (2007). Highly specific enrichment of phosphopeptides by zirconium dioxide nanoparticles for phosphoproteome analysis. Electrophoresis 28:2201–15
14. J. Li, Z. Zhang, J. Rosenzweig, Y. Y. Wang, D. W. (2002). Chan Proteomics and bioinformatics approaches for identification of serum biomarkers to detect breast cancer. Clinical Chemistry 48(8):1296–1304
15. Hubbard MJ, Cohen P. (1993). On target with a new mechanism for the regulation of protein phosphorylation. Trends Biochem. Sci. 18:172–77
16. Feng S, Ye M, Zhou H, Jiang X, Jiang X, et al. (2007). Immobilized zirconium ion affinity chromatography for specific enrichment of phosphopeptides in phosphoproteome analysis. Mol. Cell Proteomics 6:1656–65
17. Sykora C, Hoffmann R, Hoffmann P. (2007). Enrichment of multiphosphorylated peptides by immobilized metal affinity chromatography using Ga(III)- and Fe(III)-complexes. Protein Pept. Lett. 14:489–96
18. Tsai CF,Wang YT, Chen YR, Lai CY, Lin PY, et al. (2008). Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. J. Proteome Res. 7:4058–69
19. Jensen SS, Larsen MR. (2007). Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21:3635–45
20. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.Д. (1993). Аналитическая хроматография - М.: Химия. - 464 с: ил.

Останнє редагування Вівторок, 23 серпня 2016 19:14