Визначення профілю генної експресії при раку грудної залози

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Сьогодні: 26.09.2017

Визначення профілю генної експресії при раку грудної залози

(0 голосів)

Визначення профілю генної експресії при раку грудної залози

Резюме

Платформи ДНК-мікрочипів для визначення профілю генної експресії були винайдені порівняно недавно, і рак молочної залози належить до числа захворювань, які почали досліджуватися з використанням цієї технології найраніше і найінтенсивніше. Ідентифіковані за допомогою цього методу молекулярні підписи дозволяють виявити біологічний спектр новоутворень молочної залози, забезпечити діагностичні інструменти, а також створити прогностичні та предикативні підписи генів, а можливо і визначити нові терапевтичні мішені. Найкраще, щоб дані надавалися у форматі відкритого доступу для полегшення зовнішньої валідації, яка є найважливішим кроком у визначенні надійних, відтворюваних підписів генів, придатних для клінічної трансляції. Прийняті в клінічній практиці підходи, вироблені шляхом досліджень із визначення повного профілю експресії, що вже використовуються, включають скорочені версії мікрочипів, які представляють ключові дискримінаційні гени і терапевтичні мішені, кількісні тести на основі полімеразної ланцюгової реакції або імуногістохімічних сурогатних панелей (що підходять для застосування у стандартних гістологічних блоках). Зараз проводяться проспективні дослідження для визначення значимості таких інструментів для прийняття клінічних рішень при раку молочної залози; їх дані можуть слугувати моделлю для використання таких підходів при інших типах пухлин.

Вступ

Увесь час, від моменту впровадження технології ДНК-мікрочипів (1, 2) у середині 1990-х років, рак молочної залози був і залишається сферою, яка, ймовірно, найбільш інтенсивно вивчається методом визначення профілю експресії генів. ДНК- мікрочипи дозволяють дослідникам виміряти експресію десятків тисяч генів одночасно в одній пробі тканини. У такий спосіб отримуються величезні обсяги даних, що робить мікрочипи чудовим інструментом для скринінгових досліджень, для розробки гіпотез і для з'ясування широких закономірностей експресії генів у нормі і при патологіях. За останні десять років спостерігається постійне збільшення кількості робіт, в яких розглядаються підписи генів, що дозоляють пояснити біологію раку молочної залози та/або мають потенційну клінічну цінність для прогнозування ймовірної відповіді на лікування або виявлення терапевтичних мішеней для розробки ліків. Проте і досі немає одностайності в думках на обґрунтованість та відтворюваність результатів. Значною мірою це пов'язане з характером цих досліджень, де тисячі генів оцінюються на вимушено значно меншій кількості зразків (3). У зв'язку з тим, що при застосуванні набору даних такого типу існує ризик помилкових висновків (4), сформувалася ціла нова галузь біоінформатики і в даний час активно обговорюється питання про вибір найкращих інструментів для використання при аналізі даних. Для просування цієї технології клінічного лікування раку молочної залози потрібні строгий дизайн досліджень та чітка інтерпретація даних, а найголовніше — валідація результатів на незалежних когортах проб, узятих у пацієнтів (3). Такі дослідження нині перебувають на стадії реалізації.

Методологія

Методологія визначення профілю експресії
[...]

Презентація первинних даних

Очевидно, що такі питання, як нормалізація і коректна інтерпретація цих дуже великих наборів даних є предметом постійного обговорення. Це є однією з головних причин того, що серед наукової спільноти, яка займається дослідженнями мікрочипів, досягнуто консенсусу в питанні про те, що вихідні дані, на які спираються опубліковані результати досліджень, мають перебувати в широкому доступі, що дозволить дослідникам використовувати свої власні методи, щоб проаналізувати набори даних і порівняти результати досліджень. У 2001 році Товариство з даних по вивченню експресії генів за допомогою мікрочипів (Microarray Gene Expression Data Society) запропонувало стандарти анотації експериментальних даних, відомі як мінімальна інформація про експеримент із використанням мікрочипів, і в даний час цих стандартів дотримуються в провідних журналах. Дослідження, проведені для порівняння даних, отриманих при застосуванні різних платформ для використання мікрочипів у дослідженнях експресії генів, показали низьку кореляцію між вимірами мРНК з відповідних генів (22), а відмінності в підходах до аналізу даних також створюють очевидні низькі кореляції серед різних платформ (23). Однак недавні масштабні дослідження виявили технічну узгодженість між платформами і лабораторіями (24).

Дослідниками раку молочної залози піднімаються питання про те, що в різних опублікованих предикторах експресії генів число генів, які перекриваються, є надто малим, що ставить під сумнів застосовність мікрочипів як платформи для розробки узгоджених аналізів біології раку. Найпотужніший метод, який дозволяє підтвердити релевантність певного набору генів, базується на можливості визначити, якою мірою рівні експресії цього набору генів дозволяють передбачити результат у пробах, проаналізованих в іншій установі з використанням іншої платформи. У відповідь на це в одному важливому дослідженні було протестовано п'ять опублікованих предикторів прогнозу раку молочної залози на основі експресії генів (25): 70-генний профіль (26, 27), активована відповідь рани (28, 29), індекс рецидивів (12), внутрішні біологічні підтипи (30–33) і співвідношення двох генів (34) — проти загального набору з 295 первинних випадків раку молочної залози (25). Результати показують, що чотири з п'яти протестованих моделей демонструють значну узгодженість прогнозів результатів для окремих пацієнтів.

Хоча деякі з підписів профілю експресії генів у новоутвореннях, отримані за допомогою мікрочипів, підтвердити не вдалося (можливо тому, що початкові списки генів були розроблені з використанням неадекватних дизайнів валідації, що базуються виключно на внутрішньому навчанні (35)), є багато таких, які можуть бути валідовані шляхом порівняння з іншими досліджуваними наборами генних масивів або із застосуванням комплементарних методів, таких як мікрочипи тканини (TMA). Нижче ці окремі предиктори експресії генів обговорюються більш докладно. Однак є один дуже цінний ймовірний висновок, який полягає в тому, що широкий доступ до первинних даних (див., наприклад, рис. 1b) не тільки дозволяє повторний їх аналіз за допомогою нових інструментів біоінформатики, а й, що, можливо, ще важливіше, робить набір корисним для зовнішніх валідаційних досліджень інших підписів, що є найвагомішим кроком у розпізнаванні їх потенційної клінічної корисності. Окремі великі загальнодоступні сховища даних з визначення профілю генної експресії при раку молочної залози наведені в таблиці 1.

Статистичні методи

Після належної обробки і нормалізації дані для визначення профілю генної експресії за допомогою мікрочипів аналізуються з метою з'ясування біологічно і клінічно значущих закономірностей. Спеціалісти з біоінформатики розробили чимало статистичних методів, що дозволяють виявити предиктори експресії генів, які потребують ретельного застосування, щоб уникнути проблем. Якщо первинний аналіз проводиться без зовнішньої валідації набору, існує ризик того, що гени, які були визначені в початковому наборі як такі, що являють інтерес, можуть виявитися несуттєвими в інших зразках. Це явище називають «overfitting» (надто близька підгонка) (36).

У ранніх роботах у цій галузі часто просто виділяли гени з найбільшими відмінностями в експресії або такі, що асоціювалися з клінічними параметрами, але для глобальних аналізів закономірностей значно краще використовувати набори мікрочипних даних у масштабі геному. Кластерний аналіз (37-40) є одним із найбільш широко застосовуваних багатовимірних методів, що використовуються в дослідженнях експресії генів при новоутвореннях молочної залози з метою організації даних у масштабі геному. При застосуванні цього методу гени на основі їх загальної схожості групуються в патерни експресії по всіх зразках, а зразки пухлин на основі їх подібності — в експресії генів. Існують два популярні алгоритми кластеризації: ієрархічна кластеризація та кластеризація методом k -середніх.

Ієрархічна кластеризація (41-43) починається з віднесення кожного суб'єкта до певних кластерів, кожен з яких містить один суб'єкт. Потім найближчі і найбільш схожі пари кластерів об'єднуються в один новий кластер. Подібності між новим кластером і кожним із старих кластерів обчислюються знову, і це повторюється, поки всі суб'єкти не будуть об'єднані в одному всеосяжному кластері або всіх генів, або всіх пухлин. Графічним резюме даних служить дерево-дендрограма, де довжина гілок відображає ступінь спорідненості між генами або суб'єктами (рис. 2F). Одним із недоліків ієрархічної кластеризації є те, що навіть невеликі зміни в даних можуть привести до зовсім різних взаємозв'язків на дендрограмі, тобто цей вид резюме дійсний тільки в разі, якщо розбіжності в межах пари між об'єктами узгоджуються з ієрархічною структурою, що є результатом алгоритму (44, 45).

При кластеризації методом k-середніх (46) намагаються сегментувати N суб'єктів на заздалегідь встановлену кількість розділів. Коротко кажучи, оператор спочатку вибирає кількість кластерів — K. Потім алгоритм випадковим чином генерує K кластерів і обчислює у багатовимірному просторі центри кластерів, які мають назву центроїдів. Кожному суб'єкту присвоюється найближчий центроїд, обчислюються нові центроїди, і ці кроки повторюються доти, доки не будуть задовольнятися критерії конвергенції (наприклад, присвоєння суб'єктів не змінюється). Відносна простота алгоритму k-середніх дозволяє швидко опрацьовувати великі обсяги даних. Недоліком є те, що початкова кількість кластерів обирається дещо довільно, і в разі, якщо вона зміниться, то змінюється членство в кластері і члени втрачають змогу зайняти раніше присвоєні кластери.

У 1998 році Eisen та співавт. (47) впровадили ці методи в загальнодоступне програмне забезпечення під назвою «Кластер», що дозволяє експериментальним біологами з мінімальними знаннями статистичного програмування виконувати такі аналізи. Крім того, програмне забезпечення на основі Java — Treeview (48) стало доступним для відображення кластерних профілів у візуально привабливий спосіб, що часто називається «тепловою картою». Це графічне відображення є корисним інструментом для двовимірного подання закономірностей диференціальної експресії генів. При ідентифікації внутрішніх біологічних підтипів раку молочної залози (31, 33), що обговорюється нижче, використовували саме такі методи.

Неконтрольовані форми аналізу даних, такі як ієрархічна кластеризація, дозволяють розкривати внутрішньо притаманні закономірності в даних і зв'язки між генами та пухлинами, наприклад, висуваючи на передній план раніше невідомий базальтоподібний рак молочної залози (31). Для порівняння: контрольовані методи аналізу даних ідентифікують гени, чия експресія найбільш тісно пов'язана з відомою змінною, що являє інтерес, такою як ступінь диференціювання пухлини або клінічний результат. Прикладом результату контрольованого аналізу є 70-генний прогностичний підпис раку молочної залози (26), який пов'язав експресію гена пухлини (серед пацієнток віком до 55 років із пухлинами менше 5 см в діаметрі та неураженими лімфатичними вузлами) з присутністю або з відсутністю віддалених метастазів через 5 років.

Перевагою контрольованих підходів є те, що список виділених генів майже напевно буде пов'язаний з клінічним питанням, яке належить вирішити. Найбільшим недоліком є те, що, оскільки вибір генів зазвичай оптимізований проти результату з набору пацієнток з певними характеристиками пухлини і схемами лікування, то здатність узагальнювати поза набором пацієнток, з якого він отриманий, може бути обмежена.

Рівень псевдопозитивних результатів необхідно квантифікувати і обмежити для оптимізації списків генів (49), наприклад, за допомогою складних напівконтрольованих методів кластеризації і контрольованих методів основних компонентів, запропонованих Bair та Tibshirani (50), з використанням найближчих стиснутих центроїдів. Такі методи можуть служити, наприклад, для розробки клінічно практичного налаштованого міні-масиву або qRT-PCR аналізу, достатнього для класифікації пухлин молочної залози на біологічні підтипи і для прогнозування результатів. Інші варіанти контрольованого аналізу даних мікрочипів включають карти, що самоорганізуються (51), опорні вектори (52), штучні нейронні мережі (53), аналіз значення мікрочипів (54), а також аналіз збагачення наборів генів (55). Незалежно від обраного методу, як для контрольованих, так і, особливо, для неконтрольованих підходів, результати експериментів у масштабі геному однаково потребують валідації на незалежній серії пухлин.

Профілі експресії PМЗ

Профілі експресії раку молочної залози

Дослідження, спрямовані на розуміння біології пухлин молочної залози

Не дивно, що можливість вимірювання рівнів експресії одночасно десятків тисяч генів у клітинних лініях і зразках пухлин розширила наше розуміння біології раку молочної залози. Результати перших опублікованих досліджень, проведених у лабораторіях Брауна і Ботштейна в Стенфорді, показали, що мікрочипи кДНК здатні ідентифікувати експресію підписів, характерних для клітин раку молочної залози (56, 57). Аналогічне дослідження показало, що патерни експресії гена дозволяють прогнозувати інвазивний потенціал клітинних ліній раку молочної залози (58).

Перша публікація, присвячена великому дослідженню з визначення профілю експресії генів великої кількості клінічно анотованих зразків тканин пухлини молочної залози, вийшла в 2000 році. У ній Perou та співавт. (31) наводять біологічну класифікацію раку молочної залози на основі відмінних патернів генної експресії. У цьому дослідженні застосовувалася неконтрольована ієрархічна кластеризація для групування 65 зразків пухлин молочної залози, видалених хірургічно у 42 унікальних пацієнток, з використанням стиснутого списку характеристичних генів. Характеристичні гени були визначені як такі, які мають значні відмінності в експресії між різними пухлинами, але не між парами зразків тієї самої пухлини; це один із групи методів, що дозволяють обмежити аналіз підмножиною генів, варіація яких є радше продуктом біологічних відмінностей між зразками пухлини різних пацієнток, ніж змін, пов'язаних із окремою пацієнткою чи з технічною варіабельністю. Ці молекулярні інтерпретації, згодом підтверджені дослідженнями Sorlie та співавт. (32, 33), корелювали з результатом у пацієнтки і, на додаток до визнання відомих клінічно важливих підгруп, також засвідчили наявність нових підтипів раку молочної залози.

П'ять основних біологічних підтипів раку молочної залози, отриманих у такий спосіб, називаються: Люмінальний A, Люмінальний B, рак з гіперекспресією HER2 (онкобілка рецептора людського епідермального фактора росту 2, продукту гена ERBB2), базально- і нормальноподібний; відмінності між ними щодо швидкості росту, специфічних сигнальних шляхів і клітинного складу пухлини можна пояснити, принаймні частково, їх відповідними патернами експресії генів. Зокрема, в трьох клінічно агресивних підтипах раку молочної залози (Люмінальний В, базальноподібний і з гіперекспресією HER2) відзначався підвищений рівень генів проліферації. У подальших дослідженнях ці підписи показали значну відтворюваність при прогнозуванні виживаності хворих у різних когортах пацієнтів — при аналізі різними лабораторіями з використанням різних платформ масиву генів і нових неконтрольованих статистичних методів (59-62).

Одним з особливо важливих наслідків даного дослідження було виділення і визначення характеристик підгрупи базальноподібного раку молочної залози, що є біологічно відмінною групою, таргетні види терапії якої в даний час відсутні (63). Існування нового підтипу базальної карциноми молочної залози було підтверджене не тільки незалежними дослідженнями масиву генів, а й низкою імуногістохімічних досліджень на ТМА, що містять зразки карциноми молочної залози з відомими клінічними особливостями (64-66). Внутрішні підтипи, ідентифіковані за допомогою визначення профілю експресії генів, також корелюють з абераціями числа геномних копій, виявленими aCGH (67).

Ще одним цікавим патерном експресії гена раку молочної залози, що відображає біологію раку, є підпис відповіді рани, ідентифікований Chang та співавт. (28, 29); він підтримує концепцію [запропоновану H. F. Dvorak у 1986 році (68)], згідно з якою молекулярна програма, що активується при нормальному загоєнні рани, кооптує під час інвазії та прогресії раку. Цей транскрипційний підпис був виявлений на моделі культивованих, стимулюваних сироваткою фібробластів (29), і експресія цього підпису є предиктором несприятливого клінічного результату серед 295 ракових пухлин молочної залози на ранніх стадіях, покращуючи прогнозування клінічного результату, а також відображає стратифікацію ризику, представлену клінічними факторами ризику (28). Той самий підпис також є предиктором несприятливого результату раку шлунка та легень, що вказує на те, що відповідь рани характерна для різних типів пухлин. Це свідчить про те, що дослідження профілів експресії раку молочної залози мають наслідки для інших видів раку. Аналогічний підхід був використаний для ідентифікації підпису відгуку гіпоксії в культивованих клітинах молочної залози і епітелію ниркових канальців, і коли він присутній у зразках раку молочної залози, то цей підпис гена значною мірою асоціюється з несприятливим клінічним результатом, незалежно від підпису загоєння ран і стандартних клінічних параметрів (69).

У недавньому дослідженні були отримані дані на користь підпису гена "інвазивність" на основі 186 генів, включаючи гени апоптозу BCL2 і CASP8, гени хемотаксису PLP2 і CXCL2 і гени проліферації SSR1, EMP1 і ERBB4, обрані у зв'язку з тим, що вони диференційно екпресуються між CD44 + / CD24 - пухлинного походження — високо онкогенними клітинами раку молочної залози в порівнянні з отриманими шляхом редукційної мамопластики нормальними епітеліальними клітинами молочної залози (70). Цей підпис призначений для відстеження невеликої популяції клітин раку молочної залози, які поводять себе як стовбурові клітини в тестах на ксенотрансплантатах миші (71-73). Підпис генів «інвазивність» демонструє сильну асоціацію з клінічними результатами при раку молочної залози, що відповідає основній ідеї про те, що стовбурові клітини присутні і відіграють важливу роль у розвитку раку молочної залози (74, 75).

Цікаво, що, аналогічно до зазначеного вище підпису відповіді рани, цей підпис також має прогностичне значення для інших злоякісних пухлин, включаючи рак легенів, рак простати і набори даних по медулобластомі, що вказує на те, що він ідентифікує функцію загальної значущості в онкології (70). Підпис гена «інвазивність», імовірно, відстежує інший процес (скоріше, щоб відобразити ракові стовбурові клітини), ніж реакція загоєння ран (підпис, який не перекривається із зазначеним вище і більшою мірою безпосередньо пов'язаний з місцевою інвазією). Поєднання цих двох підписів дає підстави для ще більш вражаючої стратифікації ризику раку (70), який можна інтерпретувати на підтримку онкологічної гіпотези «насіння та ґрунт» (76).

Спадкові випадки становлять 5-10 % випадків раку молочної залози. BRCA1 і BRCA2 є генами сприйнятливості, мутації зародкової лінії яких беруть участь у більшості випадків сімейного раку молочної залози, а їх мутаційний статус знаходить своє відображення в профілях експресії генів пухлин соматичних тканин (32, 77). У пов'язаному з цим дослідженні масиву генів порівнювався рак молочної залози з мутацією BRCA1 з відповідними зразками спорадичних пухлин (78). Було показано, що BRCA1-асоційовані пухлини характеризуються підмножиною генів, пов'язаних із клітинною адгезією і міграцією, таких як ламініни, різні колагени і фібронектини. Сімейні не-BRCA1/BRCA2-мутовані новоутворення молочної залози можна поділити на два окремі підкласи на основі профілю експресії генів, і ці два підкласи не утворюють кластера разом з BRCA1- або BRCA2-мутованими сімейними випадками (79). Ці дані стимулювали пошук нових генів схильності до раку молочної залози серед не-BRCA1/BRCA2-мутованого сімейного раку молочної залози і мають сприяти таким дослідженням, дозволяючи ідентифікацію подібних випадків у рамках гетерогенного фону.

Дослідження, спрямовані на поліпшення діагностики раку молочної залози

У той час як визначення профілю експресії генів, безсумнівно, дає цінну біологічну інформацію для кращого розуміння розвитку раку молочної залози і його прогресування, його значення як клінічного інструмента ще не так добре доведене. Ситуація проведення діагностики забезпечує найбільш пряму можливість транслювати інформацію про генну експресію в клінічну практику. Один з відносно простих підходів полягає у вивченні профілю експресії біомаркерів, що розпізнаються існуючими діагностичними імуногістохімічними антитілами. Виходячи з цього, наприклад, була розроблена проста імуногістохімічна панель для ідентифікації базальтоподібного підтипу раку молочної залози (65). Профілі експресії генів раку молочної залози підтримуються в місцях віддалених метастазів (80), вказуючи на те, що такі тести навіть можуть мати деяке значення в умовах метастатичного раку з невідомою локалізацією первинної пухлини.

Порушення функції p53 відіграє важливу роль у прогресуванні пухлини та її стійкості до терапії (81-83). Однак звичайні методи виявлення, такі як імуногістохімія, не спроможні надійно диференціювати дикий тип в порівнянні з мутантом і з делетованим р53, що призводить до неузгоджених, а іноді й оманливих результатів досліджень. 32-генний підпис р53, побудований з профілів експресії Affymetrix U133 251 TP53-секвенуваної пухлини молочної залози, розрізняє мутант p53 від пухлин з р53 дикого типу в декількох незалежних наборах даних і дає кращі показники прогнозування клінічного результату, ніж статус мутації (84). Відповідні гени підпису p53 є не канонічними мішенями р53, вони радше пов'язані з клітинною проліферацією і ростом, транскрипцією, іонним транспортом та біологією раку молочної залози. Таким чином, цей підпис відображає чисті зміни в декількох шляхах біології раку, викликані дерегуляцією p53, для аналізу яких визначення профілю експресії підходить бідьше, ніж інші методи.

Дослідження з визначення профілю експресії генів були також пов'язані з гістологією раку молочної залози. Інвазивні лобулярні карциноми зазвичай проліферують повільніше, ніж протокові пухлини, втрачають експресію екадгерину (85) і частіше є позитивними щодо рецепторів естрогену (ER) і прогестерону (PR) (86). Вони можуть гістологічно перекриватися з протоковими карциномами і не завжди надійно розрізняються на практиці; можливо через це інвазивні лобулярні і протокові карциноми розглядаються аналогічно — на основі стадії, статусу ER і HER2.

При використанні спотованих мікрочипів кДНК контрольований аналіз 17 лобулярних пухлин проти 106 протокових пухлин молочної залози дав змогу ідентифікувати підпис 11 генів (Е-кадгеринів, сурвівіну, катепину B, TP11, SPRY1, SCYA14, TFAP2B, тромбоспондину 4, остеопонтину, HLA-G і СНС1), що дозволяє розрізнити лобулярні й протокові підтипи (87). Цей підпис чекає на зовнішню валідацію та клінічну трансляцію; в аналогічному дослідженні знайшли менш чіткі відмінності між лобулярними і протоковими карциномами (88).

На відміну від цього, запальний рак молочної залози легко визначити гістологічно і йому властиві базові підписи експресії, які відображають загальні біологічні підтипи, притаманні незапальним випадкам (89, 90). Використовуючи масив кДНК з 18 000 компонентів від Інституту раку Нідерландів, Hannemann і співавт. (91) нещодавно представили загальнодоступні дані з порівняння сорока випадків протокової карциноми з такою самою кількістю інвазивного раку молочної залози. Автори надали класифікатор 35 генів, які можуть стабільно розрізняти групи з 91%-ною точністю, серед них особливо виділяються трансформуючий фактор росту-β2 і матрицева металопротеїназа 11. Автори далі описали класифікатор, який відрізняє добре диференційовану протокову карциному in situ від погано диференційованої. Ці результати були підтверджені внутрішніми статистичними методами, але вони знову-таки потребують зовнішньої валідації та клінічної трансляції.

Повертаючись до теми спадкового раку молочної залози,слід відзначити, що поточний діагностичний тест на мутацію BRCA1/BRCA2 займає багато часу і є трудомістким. Враховуючи, що тонкі зміни на рівні ДНК можуть викликати більш глибокі й масштабні зміни на рівні РНК, визначення профілю експресії генів пропонує потенційну альтернативу виявленню носіїв мутації. Справді, не лише самі спадкові пухлини молочної залози несуть характерні підписи експресії (77-79), ненеопластичні фібробласти від носіїв мутації BRCA1 і BRCA2 також представляють чіткі підписи експресії генів після радіаційного пошкодження, відповідно до зміненої відповіді репарації ДНК (92). Якщо ця інформація буде підтверджена, вона може бути використана для створення скринінг-тесту, заснованого на чистому функціональному дефекті у таких пацієнтів, який не завжди може бути отриманий навіть шляхом секвенування.

Дослідження, спрямовані на виявлення прогностичних підписів

Гістологічна градація на основі мітотичного індексу, ядерного плеоморфізму, а також архітектурної диференціації є одним з найбільш важливих прогностичних факторів для раку молочної залози, але має помірний рівень узгодженості висновків різних патологоанатомів (93). 30–60 відсотків випадків раку молочної залози оцінюються як помірно диференційовані (ступінь 2), і ця група пухлин показує проміжний результат, що надає відносно мало вказівок для прийняття рішень щодо ад'ювантної терапії.

Використовуючи мікрочипи Affymetrix U133A і строгу стратегію навчання/тестів/зовнішньої валідації, Sotiriou і співавт. (94) ідентифікували чіткі патерни експресії генів з 97 унікальних генів, що диференціюють пухлини ступеня 1 від ступеня 3. Ці гени, в тому числі UBE2C, KPNA2, TPX2, FOXM1, STK6, CCNA2, BIRC5 (сурвівін) і MYBL2, функціонують у клітинній проліферації та прогресії і в цілому мають більш високий рівень експресії в пухлинах ступеня 3. На основі цих даних була розроблена Система бальної оцінки, яка має назву «індекс ступеня експресії генів»; вона служить для класифікації карцином молочної залози ступеня 2 на дві групи ризику, які значною мірою пов'язані з відмінністю в тривалості безрецидивної виживаності, незалежно від стандартних клінічних параметрів і статусу ER. При багатофакторному аналізі індекс ступеня експресії генів мав вищий показник співвідношення ризиків у порівнянні з іншими прогностичними факторами (у тому числі із статусом лімфатичних вузлів) і витісняв гістологічну оцінку з моделі Кокса. Ivshina і співавт. (95) у ході паралельного незалежного дослідження отримали аналогічні результати невдовзі після цього.

Пухлини молочної залози, ідентифіковані як Люмінальні А, в інших дослідженнях мікрочипів мають нижчий індекс експресії генів у порівнянні з іншими люмінальними пухлинами (96), що підтверджує думку про те, що рівні експресії генів проліферації корисні у визначенні Люмінального підтипу B з несприятливим прогнозом. Цей висновок узгоджується з даними Dai та співавт. (97), які показали, що проліферація підписів експресії генів є найбільш потужним прогностичним фактором для літніх ER-позитивних пацієнтів. Гістологи можуть оцінити активність проліферації за кількістю мітозів і/або даними імуногістохімії Ki67, але існують проблеми фіксації і мінливості методів візуального підрахунку. Ймовірно, саме це пояснює, чому панель експресії генів виконує таке завдання значно краще. На даний момент гістологічна градація настільки дешева і зручна, що її буде важко замінити навіть кращими методами оцінки. Однак якщо визначення профілю експресії генів у тій чи іншій формі стане більш клінічно доступним, підписи проліферації, схоже, зможуть знайти важливе застосування в аналізі раку молочної залози.

70-генний прогностичний підпис, визначений на основі випадків первинного раку молочної залози в Нідерландському інституті раку (26, 27), є прекрасним прикладом застосування контрольованого навчання з профілів експресії генів. Цей підпис, що показує прогностичне значення для віддалених метастазів протягом п'яти років, був вперше ідентифікований за допомогою когорти 78 пухлин без ураження лімфовузлів у жінок віком до 55 років, які не отримували системну ад'ювантну терапію, з використанням олігонуклеотидних мікрочипів (26). Представлено багато генів, пов'язаних з ознаками раку: клітинний цикл, метастазування, ангіогенез та інвазія. Цей прогностичний профіль потім був валідований на когорті 295 молодих пацієнток із того самого закладу, в тому числі з пухлинами з ураженням лімфовузлів і без ураження лімфовузлів і таких, які не отримували системного лікування (27).

Прогностичне значення 70-генного підпису було значно кращим при прогнозуванні віддаленої безрецидивної виживаності, ніж стандартні клінічні критерії здоров'я Санкт-Галлена або Національних інститутів. Оскільки в це дослідження був включений оригінальний набір даних, використовуваний для отримання прогностичного значення при його первісній валідації, занепокоєння про можливу надмірно близьку підгонку даних породило дебати серед дослідників мікрочипів (36) і залишається неясним, чи справді цей підпис працює краще, ніж Ноттінгемський прогностичний індекс (98). Утім, автори цього дослідження подбали про доступність загалу своїх первинних даних, що робить цей набір даних особливо цінним ресурсом для валідації і порівняльних досліджень, що проводяться іншими дослідниками в цій галузі (25, 28, 35, 69, 99, 100). Данська група підтвердила прогностичне значення 70-генного підпису при первинному раку молочної залози низького ризику, але представила 32-генний класифікатор, який, схоже, дає кращі результати серед підмножини дуже низького ризику (101); цей результат потребує зовнішньої валідації.

76-генний Роттердамський підпис, який був ідентифікований Wang і співавт. (102) з використанням масивів Affymetrix U133A на наборі 115 хворих на рак молочної залози, був розроблений для передбачення віддаленої частоти рецидивів у нелікованих пацієнток з неураженими лімфатичними вузлами. Цей алгоритм класифікації пройшов навчання й оптимізацію на ER-негативних і ER-позитивних пацієнтках окремо, на основі припущення, що механізми цих двох видів раку відрізняються. Гени, що утворюють підпис, беруть участь, головним чином, у реплікації і репарації ДНК, клітинному циклі та апоптозі, а також в імунній відповіді. Прогностичне значення цього 76-генного підпису було валідоване на незалежному наборі 180 нелікованих пацієнток із різних медичних закладів без ураження лімфовузлів (103), а також надане для широкого доступу.

Аналіз конкретних генів, що експресуються в первинній пухлині раку молочної залози, може також дозволити класифікувати ризики для локалізації віддалених метастазів. Було показано, що 70-генний підпис і підпис внутрішнього підтипу зберігаються між первинними і метастатичними сайтами, що підтверджує думку про те, що метастатичний потенціал властивий первинній пухлині і що метастази точно відображають біологію первинної пухлини (80). Були опубліковані генні підписи — предиктори метастазів раку молочної залози в кістки (104) і легені (105). Прогнозування ризику метастазів у кістки, зокрема, може використовуватися для визначення частоти радіологічних обстежень (наприклад, необхідності сканування кісток) та/або застосування ад'ювантних бісфосфонатів (104).

Прогностичні моделі страждають від внутрішньо притаманних їм обмежень. Загалом, різні популяції пацієнтів і статистичні методи будуть давати різні оптимальні прогностичні підписи (106, 107). Контрольовані аналізи, оптимізовані проти результатів для пацієнта, обов'язково матимуть надто близьку підгонку до наборів даних, з яких вони отримані, і, як очікується, будуть дещо втрачати прогностичну силу в валідаційних дослідженнях на інших наборах даних. Не слід очікувати, що списки генів перекриватимуть один одного, оскільки різні гени можуть відстежувати подібні біологічні процеси (25). Нарешті, незалежно від того, наскільки складним і ретельним може бути аналіз мікрочипів, існує стохастический компонент результатів для пацієнтів, який завадить створити досконалу прогностичну модель, адже існує певна неминуча частка випадковості.

Дослідження, спрямовані на передбачення відповіді пухлини на ад'ювантну системну терапію

Основною клінічною метою визначення профілю експресії генів при раку молочної залози є індивідуалізація неоад'ювантної або ад'ювантної системної терапії; звичайні біомаркери, крім ER і HER2, не дозволили досягти щодо цього значного успіху. Таким чином, багато досліджень мали на меті використовувати визначення профілю експресії генів за допомогою мікрочипів, щоб вийти за рамки прогнозних підписів при ідентифікації предикторів відповіді на препарати.

Визначення профілю експресії культур клітин до і після лікування препаратом можливо використовувати для розробки предикторів відповіді на препарат, який може бути застосований до зразків пухлини пацієнта. Зміни в експресії генів, індуковані доксорубіцином та 5-фторурацилом, що відзначаються в клітинних лініях, спостерігаються також і в пухлинних зразках від пацієнтів (108). Клітини з профілями експресії люмінального типу відповідали шляхом індукції генів контрольних точок клітинного циклу, не індукованих клітинами з базальноподібним профілем експресії, що вказує на те, що внутрішній біологічний підтип може впливати на відповідь пухлини на традиційну хіміотерапію. Використовуючи різні чутливі до хіміотерапії клітинні лінії карциноми як моделі, вдалося ідентифікувати 79-генний підпис стійкості до доксорубіцину (у тому числі Р- глікопротеїновий ефлюксний насос); це було зроблено з використанням 43 000 точкових кДНК мікрочипів (109). Цей підпис міг бути ідентифікований в загальнодоступних зразках первинного раку молочної залози і корелював з коротшою виживаністю пацієнта, хоча його ще належить валідувати на клінічному матеріалі, рандомізованому на антрациклінову проти неантрациклінової терапії.

Обробка клітинних культур естрогенами також була використана для ідентифікації підпису відповіді на естроген, у тому числі PR, RERG, CTSD і PDZ1, а також асоційованих з проліферацією генів, таких як CCNB2, CCND1, MKI67, MYBL2, BIRC5 (сурвівін) і STK6 (110). При застосуванні ретроспективно до численних незалежних наборів даних профілів експресії пухлин молочної залози цей 822-генний класифікатор прогнозує результат серед ER-позитивних і лікованих тамоксіфеном пацієнтів.

За відсутності довгострокових даних подальшого спостереження, як сурогатна кінцева точка щодо користі для пацієнта в умовах неоад'ювантної терапії використовується повна патологічна реакція, і експлоративні аналізи мікрочипів були включені в деякі дизайни клінічних випробувань. Дослідження з використанням масивів Affymetrix HgU95-AV2 для порівняння профілів експресії до і після неоад'ювантного лікування доцетакселом показало, що чутливі пухлини мають більш високу експресію генів, які беруть участь у клітинному циклі, формуванні цитоскелету, адгезії і транспортуванні білка та модифікації (111), тоді як стійкі пухлини експресують мішень рапаміцину в клітинах ссавців (mTOR). Це невелике дослідження (N = 13) вимагає підтвердження, а припущення, що інгібітори mTOR можуть бути використані при розробці ефективної комбінованої терапії, потребує експериментальної перевірки.

На противагу цьому, Hanneman і співавт. (112) не змогли згенерувати предиктори експресії патологічної відповіді у 24 хворих на рак молочної залози, що отримували неоад'ювантну терапію за схемою доксорубіцин-циклофосфамід, і 24 — за схемою доксорубіцин-доцетаксел (Т > 3 см і/або уражені лімфовузли) за допомогою 18 000 точкових кДНК мікрочипів. Дослідження 31 000 кДНК мікрочипів за участю 42 пацієнтів (24 для відкриття класифікатора і 18 для валідації) дало 74-генний класифікатор для прогнозування повної патологічної реакції на неоад'ювантну хіміотерапію за схемою паклітаксел-фторурацил-доксорубіцин-циклофосфамід (Т/FAC) (113). У цьому разі розбивка навчання-валідація виявилася дуже підхожим дизайновим методом, але залишала невелику кількість подій у кожній групі, що давало результати валідації з пограничним значенням і низькою чутливістю (дослідження правильно передбачило трьох з семи пацієнтів, які справді відповіли на лікування, і одинадцять з одинадцяти, які не відповіли).

Профілі експресії від 37 пацієнтів з локальною прогресією пухлини, які отримували неоад'ювантну липосомальну хіміотерапію доксорубіцин — паклітаксел оцінювали з використанням мікрочипів U133 Plus 2.0 (114) і пов'язували з клінічним результатом. Не було встановлено тісного зв'язку з клінічною відповіддю або патологічною відповіддю первинного сайта первинної пухлини, хоча був створений список генів, які прогнозують участь вузлів при наступній операції, що мали спільне прогностичне значення в одновимірному аналізі в двох інших серіях.

Цінними для майбутніх досліджень можуть бути заздалегідь зібрані зразки до і після неоад'ювантної терапії, які слугуватимуть для перевірки вже існуючої гіпотези про генних предикторів радше, ніж якщо будуть принесені в жертву аби використані для виведення списків нових предикторних генів (цей аналіз може і повинен виконуватися і надалі як другорядний аналіз даних, отриманих з використанням таких зразків). Наприклад, у дослідженні за участю 82 пацієнтів, що отримували неоад'ювантну терапію Т/ FAC, в яких був визначений профіль за допомогою мікрочипів U133A, патологічна повна відповідь (pCR) була значно вищою у випадках профілю експресії, де мала місце експресія підписів раніше встановлених базальтоподібних і HER2-позитивних підтипів (обидва з 45% pCR), ніж у люмінальних пухлинах (2 з 30 pCR) або нормальноподібних (0 з 10 pCR) (115). Потім за допомогою контрольованих методів аналізу генерувалися пошукові списки генів, що корелюють з pCR, і, що цікаво, вони цілком різнилися у випадку базальтоподібного типу і HER2-типу, що вказує на те, що пухлини з різною внутрішньою біологією використовують різні механізми стійкості до лікарських засобів.

Одним із питань, на яке не знайдено відповіді, є те, чи перевершують молекулярні профілі доступні клінічні і патологічні параметри. Дослідження мікрочипів з використанням 28K кДНК показало, що профілі експресії генів спрацьовують так само добре (але не краще), як класифікатори на основі клінічних параметрів і Ноттінгемського прогностичного індексу, коли йдеться про прогнозування шансів рецидивів у когорті з 85 хворих на рак молочної залози у пременопаузі з ураженими лімфатичними вузлами, які отримували ад'ювантну терапію за схемою CMF (циклофосфамід, метотрексат і 5- фторурацил) (116). Ця група хворих зазвичай отримує агресивне лікування, і потенціал для ідентифікації будь-кого, хто міг би обійтися без хіміотерапії, був би клінічно значущим.

ER-позитивні пухлини, як правило, асоціювалися з кращими клінічними результатами і хорошою відповіддю на гормональні методи лікування, такі як тамоксифен (117). Проте у частини хворих трапляються рецидиви, а у до 40% розвивається стійкість до тамоксифену (118). Результати рандомізованих досліджень дозволяють припустити, що інгібітори ароматази можуть знижувати ризик рецидиву (особливо у віддалених ділянках) пухлин молочної залози, що відповідають на гормональну терапію в постменопаузі (119-122). Відповідь на таку гормональну терапію може корелювати з глобальними патернами експресії генів серед ER-позитивних пухлин молочної залози.

Використовуючи мікрочипи 18000 кДНК, Jansen і співавт. (123) визначили профіль 10-20-річних заморожених зразків первинної пухлини пацієнтів, які отримували ад'ювантну терапію тамоксифеном. Вони визначили 81-генний підпис (на 26 % за участю дії естрогену, 14 % — апоптозу, 9% — формування позаклітинної матриці і 6 % — імунної відповіді), за допомогою якого можна було відрізнити 21 пацієнта з об'єктивною відповіддю від 25 з прогресуючим захворюванням. Цей список був скорочений до 44-генного оптимального прогнозного підпису і валідований на окремому наборі з 66 пухлин молочної залози, що підтверджує істотне прогностичне значення щодо більшої тривалості часу до прогресування. Загальна точність щодо можливості класифікувати резистентність до тамоксифену становила 80 %.

В аналогічному дослідженні Ма і співавт. (34) були використані 20 000 олігонуклеотидних мікрочипів для визначення профілю 60 заморожених зразків первинної пухлини жінок, які отримували тамоксифен, з яких вони виокремили двогенний індекс-предиктор резистентності до тамоксифену. Гени HOXB13 і IL17BR не мали раніше охарактеризованої функціональної причетності до резистентності до тамоксифену. Початкова валідація була виконана на 20 незалежних випадках методом qRT-PCR, який можна без проблем застосовувати при роботі з фіксованими формаліном тканинами. Наступні дослідження з валідації показали, що цей коефіцієнт може застосовуватися для прогнозу лише щодо недегенеративних пухлин молочної залози (124), і незалежні групи не змогли верифікувати потужну конкордатність з іншими предикторами, отриманими методами визначення профілю (внутрішній підтип, 70-генний підпис «Амстердам», підпис загоєння ран і підпис індексу рецидивів) (25).

Стандартні фіксовані формаліном парафінові блоки тканин легше піддаються аналізу методом qRT-PCR (рис. 2), ніж повному аналізу з визначенням профілю методом мікрочипів. Використання такого матеріалу полегшує клінічну трансляцію і дозволяє проводити ретроспективний аналіз раніше взятих великих когорт, щодо яких існують катамнестичні дані. Ґрунтуючись на опублікованих наборах даних мікрочипів, у тому числі внутрішньо притаманних підтипів і 70-генних підписів «Амстердам», були розроблені тести qRT-PCR для 250 генів (які разом, по суті, складають частковий профіль експресії) і після тестування в ході трьох незалежних клінічних досліджень був відпрацьований оптимізований 21-генний аналіз (16 дискримінаторів і 5 внутрішніх елементів контролю) для прогнозування рецидиву у ER-позитивних пацієнтів без ураження лімфатичних вузлів, які отримують ад'ювантну терапію тамоксифеном. Отримана в результаті оцінка рецидивів надає диференціальні вагові коефіцієнти причетним генам (проліферація: MKI67, STK15, BIRC5/сурвівін, CCNB1, MYBL2; відповідь на лікування естрогеном: ER, PGR, SCUBE2; HER2 амплікон: ERBB2, GRB7; локальна інвазія: MMP11, CTSL2; антиапоптотична дія: BCL2, BAG1; метаболізм лікарських препаратів / антиоксидант: GSTM1; відповідь макрофагів: CD68) на основі побудови моделі в навчальних наборах даних, і було показано, що вона дає кількісну оцінку ймовірності віддалених метастазів у 668 випадках ER- позитивних пухлин молочної залози без ураження лімфатичних вузлів, лікованих тамоксифеном у дослідженні B14 у рамках Національного хірургічного проекту дослідження ад'ювантної терапії при новоутвореннях молочної залози і кишечнику (NSABP) (12).

У виконаному пізніше дослідженні оцінювалася продуктивність цього аналізу на 651 ER-позитивних і недегенеративних пухлинах молочної залози, які в рамках B20 NSABP були рандомізовані в групи лікування тамоксифеном або тамоксифеном в поєднанні з хіміотерапією (125). Пацієнтки з високим значенням показника рецидивів отримали велику користь від хіміотерапії (відносний ризик — 0,26; середнє абсолютне зниження 10-річної частоти системних рецидивів — 27,6 %), в той час як у групі з низькою частотою рецидивів (54 % пацієнтів), по суті, ніякої користі пацієнти не отримали. З огляду на такий вражаючий результат цей тест був швидко запропонований як комерційний (Oncotype DxTM). Проте це залишається спірним, оскільки набір з 651 пацієнтки включав 227 випадків з групи тамоксифену в дослідженні NSABP B20, дані яких були використані під час фази розробки моделі, а потім були знову залучені до більшого за обсягом комбінованого набору даних, що спричинило те, що передбачення користі від хіміотерапії набуло більш вагомого характеру (126). Як і у випадку інших комерційно доступних тестів (наприклад, MammaPrint), залишається також невідомим, чи забезпечує він економічно ефективний прогрес у порівнянні зі стандартними клініко-патологічними факторами, які звичайно отримують на всіх пацієнтах.

Предиктивні аналізи користуються великим попитом і є рушійною силою для ухвалення рішень щодо клінічної допомоги. У кінцевому рахунку для того, щоб довести клінічне значення експресії підписів, необхідні проспективні клінічні дослідження, в ідеалі прийняття рішень у них має бути рандомізованим щодо того, чи рішення базується на стандартних клініко-патологічних факторах чи на інформації, отриманій із профілів експресії підписів. У даний час здійснюються проспективні дослідження з оцінки 70-генного підпису «Амстердам» і 21-генного аналізу для оцінки рецидивів; очікується, що згадані дослідження допоможуть вирішити ці проблеми (докладніше описано нижче).

Дослідження для визначення терапевтичних мішеней

Попередні технології, що використовуються для аналізу широких аспектів біології пухлини, таких як гістоморфологія та хромосомне каріотипування, безпосередньо не дають інформації про чутливість до лікарських засобів. Мікрочипи не лише визначають широкі патерни експресії генів, важливі для біології пухлини, а й пов'язують ці патерни із специфічними генами, які можуть бути мішенню для зареєстрованих чи експериментальних препаратів. Реідентіфікація генів ESR1 (що кодує ER) і ERBB2 (кодує HER2) як центральних генів у межах ідентифікованих підтипів раку молочної залози, що було з'ясовано за допомогою визначення профілю експресії із застосуванням мікрочипів, слугує для валідації цієї технології як засобу виявлення відповідних мішеней для препаратів (31). При молекулярному базальтоподібному фенотипі не експресується ні ER, ні HER2, але відбувається характерна збиткова експресія рецептора епідермального фактора росту (32, 33, 56, 65), яка виступає мішенню для кількох нових препаратів, що використовуються при колоректальних новоутвореннях, новоутвореннях голови і шиї, і карциномах легенів; один із цих препаратів (ерлотиніб) показав активність у експериментальному випробуванні при карциномі молочної залози (127).

У ранніх дослідженнях з використанням спотованих масивів, що базуються на мембрані, з метою скринінгу 124 генів на 18 пухлинах молочної залози ESR1 і HSP90 були виділені як найкращі мішені (128). У сучасних дослідженнях використовуються мікрочипи, що вимірюють понад 40000 транскриптів у більш ніж 100 зразків одночасно; в одному з останніх досліджень, в якому поєднувалися профілі експресії з даними визначення профілю геномної експресії aCGH, ERBB2, FGFR1, IKBKB, PROCC, ADAM9, FNTA, ACACA, PNMT і NR1D1 були виділені як найкращі мішені, що потенційно можуть піддаватися дії наявних лікарських засобів (67). Інші дослідження запропонували матричні металопротеінази (129) або NFκB (130) як ключові мішені, зокрема при гістологічних підтипах раку молочної залози. Потенційно перспективними є дані про те, що можна в деяких випадках надати властивостей явної незалежності від естрогену і резистентності до тамоксифену шляхом підвищення активності рецепторів андрогенів (131, 132); це вказує на те, що у цих пацієнтів мала б місце стійкість до інгібіторів ароматази при чутливості до антиандрогенів. Такі дані свідчать про можливість через виявлення профілю експресії генів визначати шляхи, які, хоч і стосуються лише меншості хворих на рак молочної залози, проте можуть бути мішенню для існуючих препаратів, що сприяє розвитку персоналізованої медицини.

Однак важливо розуміти, що експресія генів, зокрема в дослідженні з використанням мікрочипів, необов'язково корелює з ідентифікацією корисної терапевтичної мішені (табл. 2). Експериментальна валідація, у тому числі типові аналізи чутливості до препарату in vitro, є необхідним кроком, навіть якщо в зразках раку молочної залози експресується мішень загальновизнаного препарату. Виявлення профілю експресії є лише методом скринінгу, хоча й напрочуд всеосяжним, для визначення мішеней для лікарських препаратів.

Прогнозування

Проблеми і майбутні напрями

Потенційні обмеження досліджень визначення профілю експресії при раку молочної залози

Поява прогностичних (асоційованих із клінічним результатом) і предикативних (асоційованих із відповіддю на терапію) підписів експресії генів є перспективним напрямом для спроб індивідуалізувати лікування раку молочної залози, однак деякі дослідження дали підстави для стурбованості з приводу клінічної застосовності цих опублікованих підписів. Одна з проблем полягає в тому, що 76-генний підпис, який був визначений Wang і співавт. (102) для прогнозування віддалених метастазів при нелікованих недегенеративних новоутвореннях у пацієнтів всіх вікових груп, мав лише три спільних гени з 70-генним підписом, розробленим групою «Амстердам» (van't Veer, van de Vijver і співавт.) для прогнозування п'ятирічного ризику віддаленого метастазування для пацієнтів молодше 55 років без ураження лімфатичних вузлів (26, 27). Це не може бути віднесене лише на рахунок використання різних платформ мікрочипів (платформи Affymetrix та Agilent мають чимало функцій, що перекриваються, зокрема для охарактеризованих генів, які відіграють важливе значення при раку), так само, як і на рахунок часткових відмінностей у критеріях відбору пацієнтів.

Складається враження, що при раку молочної залози різні набори генів, які отримані з використанням різних підходів і, можливо, є наслідком різних біологічних процесів, здатні приводити до створення прогностичних моделей з високим ступенем значущості. Так, хоча видається, що узгодженість між дослідженнями у фактичних списках генів незначна, проте в нещодавній роботі, де порівнювалося п'ять незалежних опублікованих підписів гена раку молочної залози (25), було підтверджено, що чотири з них однаково добре корелюють з виживаністю за умови застосування до одного загального первинного набору мікрочипових даних (26-28). До чотирьох підписів генів, що продемонстрували значну узгодженість у прогнозах результатів для пацієнтів, належать такі: 70-генний підпис «Амстердам», відповідь загоєння ран, 21-генний підпис qRT-PCR коефіцієнта рецидивів і підписи внутрішніх молекулярних підтипів. Цей важливий результат означає, що, незважаючи на відмінності в генних списках, ці окремі підписи можуть зробити рівний внесок в прогностичний простір при раку молочної залози (133). Тільки співвідношення двох генів (HOXB13: IL17BR) не продемонструвало прогностичного значення в цьому дослідженні, при цьому аналогічний результат був показаний також іншими групами дослідників (134).

Є також інший підхід, спрямований на те, щоб розробити більш надійні підписи генів. Так, в одному дослідженні було показано, що поєднання крос-платформних наборів мікрочипових даних (135, 136) в один набір даних спроможне дати у підсумку підпис із більш високою предикативною потужністю, що може бути більш широко узагальнене (137). Ці дані підкреслюють, знову ж таки, наскільки важливо зробити вихідні мікрочипові дані загальнодоступними, щоб можна було здійснювати зовнішню валідацію, оптимізацію та мета-аналіз. Можлива системна помилка відбору при виділенні важливих генів з тисяч вимірів (138), що говорить про необхідність оцінити частоту помилок шляхом перехресної валідації або бутстрепінгу в процесі відбору генів. Використовуючи той самий набір даних, з яких був початково отриманий 70-генний підпис (26), незалежна група показала, що може бути відібрано багато предикативних списків генів, які однаково добре корелюють із виживаністю, однак при замірах у різних групах пацієнтів кореляція коливається (100). Аналогічне спостереження було зроблено в іншому дослідженні, де йдеться про те, що при використанні того самого набору даних продуктивність молекулярних підписів генів може бути нестабільною і залежить від вибору підмножин пацієнтів при створенні навчальних наборів даних (35).

Після початкового сплеску описових публікацій про профілі раку молочної залози такі дослідження набирають дедалі більшого значення, і елементи зовнішньої валідації та доступності даних нині є обов'язковими для публікацій результатів досліджень із визначення профілів експресії генів у провідних журналах. У недавній публікації, присвяченій дослідженню, розробленому з метою визначення цінності математичного методу, який має назву «Ймовірно приблизно правильне» (Probably Approximately Correct) і призначений для квантифікації стабільності підписів генів, повідомляється, що на етапі дослідження проблеми можуть знадобитися профілі експресії генів з тисяч випадків раку молочної залози, щоб вивести справді вичерпний предикативний список генів, які можуть перекриватися на більш ніж 50 % з іншим списком генів, отриманих з аналогічних зразків (139). Визначення профілів на основі дослідження проблеми за цією шкалою буде практично неможливо реалізувати. Проте слід мати на увазі, що на сьогодні показано, що оригінальний 70-генний підпис, як і ряд інших підписів, згаданих вище, є потужним предиктором, незалежно від традиційних прогностичних маркерів у різних наборах ретроспективної валідації.

Що стосується питання про технічну узгодженість різних платформ, то було підтверджено, що модель внутрішніх підтипів, наприклад, показує послідовне віднесення до одного і того самого класу на трьох платформах мікрочипів: 60-мірних олігонуклеотидних мікрочипах Applied Biosystems, мікрочипах кДНК Stanford і 60-мірних олігонуклеотидних мікрочипах Agilent (140) і в подальшому валідованих проти qRT-PCR для мінімальної підмножини дискримінаторних генів. Крім того, базальний підтип раку, що розпізнається за допомогою цих платформ для визначення профілю експресії, був підтверджений за допомогою імуногістохімії на ТМА (що додатково обговорюється нижче).

Внесок неракових елементів до профілів експресії раку молочної залози

Пухлинні зразки містять складну суміш інвазивних злоякісних епітеліальних клітин і строму, що їх оточує і містить фібробласти, міофібробласти, ендотеліальні клітини, жир, лаброцити і запальні клітини. Крім того, зразки, що використовуються для досліджень масивів генів, можуть містити нормальну тканину молочної залози або карциноми in situ. Фундаментальне обмеження при визначенні профілю експресії полягає в правильному віднесення вимірів експресії генів до ракових клітин як таких. Цей процес трудомісткий і тому неминуче знижує пропускну спроможність, але це питання можна вирішити за допомогою лазерної мікродисекції (60, 141, 142) або аналогічних методів. Allinen і співавт. (143) застосували сортування клітин із застосуванням магнітних кульок у поєднанні з серійним аналізом експресії генів, щоб визначити профіль транскрипції стромальних і епітеліальних клітин у нормальній молочній залозі, карциномі in situ та інвазивній карциномі молочної залози. Як мінімум, заморожені зрізи пухлинної тканини, що використовувалися для виділення РНК, повинні бути розрізані і досліджені гістологом, щоб підтвердити, що зразок правильно діагностований і репрезентативний для пухлини, а також визначити відсоток ракових клітин.

До певної міри внески у підпис строми, нормального епітелію і запальних клітин можуть бути відділені методами біоінформатики, але багато генів можуть функціонувати по-різному в різних клітинах і, отже, огульне віднімання таких генів, ймовірно, не буде доречним. Крім того, непухлинні елементи, прилеглі до пухлини, мають свої власні відмінні, аномальні підписи (60). Стромальні підписи при раку молочної залози можуть бути зіставлені з підписами м'яких тканин пухлини (99): у дослідженні з метою перевірки і підтвердження принципу дії з використанням профілів експресії двох пухлин м'яких тканин було показано, що строма при агресивних пухлинах молочної залози нагадує підпис солітарної фірброзної пухлини (аналогічної до фібробластів, що створюють основу епітеліальних клітин), тоді як строма в менш агресивних пухлинах експресує підпис, подібний до фіброматозу [схожий до рубців і притаманний також стромі нормальної молочної залози (60)].

Зверніть увагу, що внески непухлинних стромальних елементів все одно дуже важливі для загальної біології пухлини і можуть мати чітке відношення до прогнозу (144). Проте якщо дані експресії добуваються для діагностичних маркерів або терапевтичних цілей, то гени, що експресуються в стромальних клітинах, не будуть такою самою мірою специфічні для конкретного захворювання. Препарати, що мають за мішень ген стромальних клітин, можуть мати більшу здатність справляти побічні ефекти на нормальні тканини, проте такі препарати можуть також бути особливо ефективними, оскільки клітина-мішень позбавлена притаманної популяції ракових клітин спроможності швидко набувати мутації стійкості. Крім того, підписи стромальних реакцій, що спостерігаються при карциномі молочної залози, можуть бути притаманні, принаймні частково, іншим типам карцином, а отже, це може привести до розробки лікарських препаратів, які будуть ефективними при різних епітеліальних злоякісних новоутвореннях.
Враховуючи проблеми з віднесенням профілів експресії генів, отриманих зі складної суміші клітин, на рахунок окремих типів клітин у межах зразка, технологія ТМА (145) стала цінним інструментом для ефективної валідації профілів експресії з морфологічною кореляцією (146).

ТМА будуються шляхом перенесення невеликих ядер парафінованих зразків тканини на блок-одержувач, що дозволяє оцінити в одному експерименті експресію одного біомаркера в сотнях пацієнтів. Це має ту перевагу, що надає доступ до великих банків існуючих зразків пухлини, незалежно від тих, які використовуються для визначення профілю експресії, які, можливо, можна співвіднести з уже наявними даними про результати лікування відповідних пацієнтів. Основним обмеженням є здатність валідувати тільки один ген за раз, і аналіз на основі ТМА справді обмежується методами, застосовними до фіксованих формаліном парафінових зразків тканини (у першу чергу, це аналіз на рівні білка імуногістохімічними методами і аналіз мРНК і ДНК методом в гібридизації in situ).

На базі використання TMA з прив'язкою до клінічних результатів можуть бути розроблені сурогатні імуногістохімічні панелі, що дасть можливість узагальнити біологічні підгрупи раку молочної залози, отримані з повних профілів експресії генів. Базальноподібний внутрішній підтип можна ідентифікувати, використовуючи панель загальновживаних імунобарвників, що розпізнають ER, PR, HER2, рецептор епідермального фактора росту і цитокератин 5/6 (рис. 3) (65). Ця панель зберігала свою прогностичну цінність при використанні на незалежній когорті пацієнтів, і з урахуванням оцінки стандартних гістологічних блоків базальноподібний підтип раку молочної залози був особливо поширений серед афроамериканських пацієнток у пременопаузі (147).

Нові прогностичні панелі імунофарбування також можуть бути ідентифіковані за допомогою TMA (148).

Генні предиктори як діагностичні тести для клінічного використання

21-генний тест є комерційно доступним під назвою Oncotype DX. Цей тест вимагає відправки парафінових блоків тканини до американської лабораторії для аналізу методом qRT-PCR, і в даний час він оцінюється проспективно у великому клінічному випробуванні, що зветься «Дослідження з призначення індивідуалізованих варіантів для лікування (TAILORx). За підтримки Національного інституту раку та у співпраці із Східною об'єднаною онкологічною групою дослідження TAILORx було започатковане в травні 2006 року і набирає понад 10 000 хворих на рак молочної залози з діагнозом ER- або PR-позитивний, HER2-негативний рак молочної залози в 900 дослідницьких центрах по всій території Сполучених Штатів. Кожна пухлина буде мати індекс імовірності рецидиву, що визначається за допомогою мультигенного тесту qRT-PCR, і пацієнтки з помірним індексом імовірності рецидиву будуть рандомізовані для отримання ад'ювантної гормональної терапії з хіміотерапією або без неї. Дослідження TAILORx призначене для оцінки того, чи мають пацієнти з помірною ймовірністю рецидиву користь від ад'ювантної хіміотерапії і чи спроможний 21-генний тест для оцінки індексу рецидиву допомогти у розробці планів лікування для цих пацієнток.

70-генний підпис тепер доступний як індивідуально розроблений, конденсований мікрочип, відомий під назвою MammaPrint (7), і нещодавно він отримав схвалення Управління з контролю за харчовими продуктами і лікарськими засобами (FDA). Для проведення тесту потрібно відправити зразок свіжої пухлинної тканини в лабораторію компанії в Нідерландах. 70-генний підпис, отриманий таким чином, був валідований шляхом аналізу історичної когорти задля того, щоб: передбачити на ранніх етапах віддалений рецидив (149); забезпечити додаткову прогностичну інформацію понад те, що може бути визначене на підставі віку пацієнтки і ступеня диференціювання пухлини, розміру і статусу ER (149) і давати щонайменше не гірші результати, ніж оцінка ймовірності клінічних результатів, отриманих за допомогою інструмента «Adjuvant!»: (http://www.adjuvantonline.com) (150, 151).

Велике проспективне дослідження під назвою «При застосуванні мікрочипів при захворюванні без ураження лімфатичних вузлів можна уникнути застосування хіміотерапії» (MINDACT) було започатковане в липні 2006 року і в даний час набирає 6000 пацієнтів на ранніх стадіях раку молочної залози без ураження лімфатичних вузлів із метою вивчити користь і ризик хіміотерапії у пацієнтів, що мають суперечливі оцінки ризику на підставі 70-генного підпису в порівнянні з клініко-патологічними факторами ризику на основі інструмента «Adjuvant!». Це дослідження проводиться Міжнародною групою з дослідження молочної залози і координується Європейською організацією з дослідження та лікування раку. Мета дослідження MINDACT полягає в проспективній оцінці того, чи можуть 10 % -15 % хворих на рак молочної залози з низьким ризиком уникнути необхідності застосування ад'ювантної хіміотерапії на основі результатів, отриманих за допомогою мікрочипу MammaPrint (152). Оскільки цей підпис експресії, для визначення якого потрібна свіжа тканина, не міг бути застосований в ретроспективних дослідженнях з відомим результатом лікуванням та інформацією про клінічний результат, то перенесення такого підпису експресії генів уперед, на дослідження третьої фази, було необхідним, сміливим кроком. На відміну від дослідження TAILORx, де всі пацієнтки повинні отримати молекулярний тест, пацієнтки — учасниці дослідження MINDACT — будуть рандомізовані, щоб отримувати цей тест або ні, що забезпечує особливо сувору оцінку того, чи полегшує застосування профілю експресії рішення про лікування в порівнянні з нинішніми методами золотого стандарту.

Висновки

Аналіз з визначення профілю експресії генів є галуззю, що швидко розвивається: нові та поліпшені платформи і методи аналізу даних з'являються практично щомісяця. Загальні принципи, які були встановлені, включають цінність широкого доступу до первинних даних і необхідність зовнішніх валідаційних досліджень, — це уроки, які також повинні бути застосовані до інших методів з високою пропускною здатністю, таких як aCGH та дослідження з протеоміки. Були описані кілька підписів експресії генів, пов'язаних із біологією раку молочної залози, діагностикою, передбаченням та прогнозуванням, і ця методологія має чудовий потенціал як інструмент пошуку інформації для нових методів лікування. З деякими змінами ця методологія застосовується для клінічних зразків, і вже з'явилися комерційні тести. Такі тести оцінюються в проспективних дослідженнях, результати яких стануть доступні лише через декілька років. Проте дослідження з визначення профілю експресії генів при раку молочної залози перебувають на значно більш просунутій стадії, ніж дослідження, що стосуються інших солідних пухлин, і містять важливу інформацію про те, як методологія визначення профілю експресії може бути використана, щоб допомогти хворим на рак.

Підсумки

  1. Існує кілька технічних платформ і статистичних методів для генерації та аналізу профілів експресії генів, і ця сфера продовжує швидко розвиватися.
  2. Широкий доступ до даних первинних мікрочипів у доступному форматі є життєво важливим не лише для забезпечення застосування альтернативного інструментарію для аналізу даних, а й для надання наборів даних для зовнішніх валідаційних досліджень.
  3. Уже опубліковані підписи експресії генів, які стосуються біології раку молочної залози, діагностики, прогнозу і реакції на лікування; деякі з них були підтверджені в незалежній серії.
  4. У даний час ведуться масштабні проспективні клінічні випробування для оцінки цінності профілів експресії генів для прийняття клінічних рішень при раку молочної залози.
  5. Отримані уроки щодо дизайну дослідження та одержані результати стосовно біології раку молочної залози є актуальними і для пухлин інших типів.

Питання на майбутнє

  1. Зовнішня валідація є вкрай необхідною, щоб оцінити клінічне значення конкретних підписів, і неоад'ювантні дослідження, зокрема, повинні включати плановані спроби перевірки опублікованих предикативних підписів на додаток до пошукових досліджень, спрямованих на виявлення нових підписів.
  2. Для того, щоб технології визначення профілю експресії генів отримали широке клінічне застосування, необхідні докази того, що такі технології можуть сприяти економічно ефективному поліпшенню прийняття рішень щодо лікування пацієнта в порівнянні зі стандартними клініко-морфологічними методами.

Література

Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2008. 3:67–97

Останнє редагування Вівторок, 08 липня 2014 08:37
Ви тут: Home