Методи білкового гель-електрофорезу

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Сьогодні: 26.09.2017

Методи білкового гель-електрофорезу

(0 голосів)
pic1 3.1.1

Рис 1. Прилад для гель-електрофорезу
у вертикальних трубках. Адаптовано з [9]

Біологічні зразки піддають обробці з використанням спеціальних протоколів з метою виділення білкової фракції. Отримані препарати з широким спектром білків перед аналізом збагачують та фракціонують, що зумовлено особливостями їхньої структури. Для гель-електрофорезу найчастіше застосовують підходи до розділення білків, що ґрунтуються на розмірі білків або їх фізико-хімічних властивостях. До методів білкового гель-електрофорезу належать:

· одновимірний електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) (Оne Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 1D-PAGE);

  • двовимірний електрофорез у гелі (Two Dimensional Gel Electrophoresis, 2DE):

1) двовимірний електрофорез у ПААГ (Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 2D-PAGE) з додатковим електрофорезом в ПААГ за присутності додецилсульфату натрію (Sodium Dodecyl Sulphate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE);

2) двовимірний диференціальний електрофорез у гелі (Two Dimensional Differential In-Gel Electrophoresis, 2D-DIGE).

1D-PAGE - одновимірний електрофорез у ПААГ, за допомогою якого розділяють білки, зважаючи на їхній розмір. Білки невеликої молекулярної маси рухаються через гелеву матрицю під дією електричного струму і проходять через неї швидше, ніж білки з великою молекулярною масою.

forma_polimerizacii

Рис 2. Форма для полімеризації. Адаптовано із [9]

Отриманий гель фарбують різноманітними реагентами (барвник Кумассі, фарбування сріблом [1], флуоресцентними барвниками [2], радіоактивними мітками) для візуалізації білкових смуг і кількісного визначення з метою подальшого виготовлення препаратів та їхнього аналізу іншими методами. Недоліком методу є низька роздільна здатність:

– неможливо відокремити конкретний білок за один раз через розділення білків препарату на групи по кілька десятків білків з однаковою молекулярною масою;

– неможливо відокремити білки близьких розмірів (ізоформи білків).

Як приклад застосування, можна навести роботу [3].

Метод 2DE двовимірний електрофорез у гелі – представлений двома варіантами: 2D-PAGE та 2D-DIGE, що мають широке застосування в сучасних дослідженнях.

2D-PAGE – двовимірний електрофорез у ПААГ дозволяє спочатку білки розділити в смузі гелю у відповідності з їх ізоелектричною точкою, де сумарний заряд білка дорівнює нулю; після чого смугу гелю розміщують поверх стандарту SDS для того, щоб білки розділились за їх розміром (метод SDS-PAGE) [4]. Принцип методу заснований на порівнянні інтенсивності плям білків у гелях, отриманих із різних зразків. 2D-PAGE метод долає більшість обмежень, властивих 1D-PAGE [5]. Технологія дозволяє розділити, візуалізувати та ідентифікувати декілька тисяч білків кожної дослідної суміші в одному гелі.

Недоліки методу 2D-PAGE наступні:
1) низька пропускна здатність, оскільки одночасно можуть оброблятися тільки два зразки;
2) метод потребує значної кількості біологічного матеріалу для кожного дослідного зразка;
3) техніка виконується за трудомістким протоколом з великими часовими затратами;
4) має місце варіабельність між гелями, що може впливати на відтворюваність результатів.

pic3 3.1.1

Рис 3. 1D-PAGE. Вертикальний білковий гель-електрофорез в 
поліакриламідному гелі. Адаптовано із [10]

Однією із значних переваг 2D-PAGE є здатність розділяти ізоформи білка. Посттрансляційні модифікації змінюють заряд білка і його молекулярну масу, які впливають на положення в гелі. Гетерогенні популяції модифікованих білків можна досліджувати використовуючи 2D гель у поєднанні з антитілами, специфічним флуоресцентним фарбуванням або міченням радіоактивними речовинами для подальшого аналізу за допомогою мас-спектрометра.

2D-DIGE – двовимірний диференціальний електрофорез в гелі, є вдосконаленим варіантом методу 2D-PAGE, що забезпечує значне покращення відтворюваності результатів за рахунок застосовування внутрішніх стандартів і розробки вдосконалених алгоритмів, а також використання програмного забезпечення для правильного розміщення білкових плям відносно маркера ваги на картинці гелю в програмі і квантифікації між різними гелями та кількісної оцінки білків двох або трьох зразків в одному гелі [6-8]. Були запропоновані технічні вдосконалення, зокрема, іммобілізований pH градієнт гелів, диференціальне багаторазове фарбування фосфопротеїнів, глікопротеїнів та мультиплексне радіоактивне мічення. Принцип методу полягає в тому, що для порівняння зразків в експерименті із застосуванням 2D-DIGE беруть участь два пули білкових екстрактів молекулярна маса і заряд яких співпадають. Екстракти мітять спектрально відмінними флуоресцентними ціаніновими барвниками (так звані «CyDye DIGE Fluor saturation» барвники) Cy3 і Cy5 відповідно, змішують разом для спільної роботи в одному гелі. Характер міграції візуалізують дуплексні 2D зображення, які отримують шляхом сканування гелю за допомогою флуоресцентного томографа після збудження гелю при довжинах хвиль, що відповідають кожному з барвників. Аналіз кожного з барвників дозволяє кількісно оцінити кожну пляму білка.

Перш ніж ідентифікувати та/або кількісно оцінювати білкові фракції, використовуючи мас-спектрометрію (Mass Spectrometry, MS) і відповідні бази даних (БД), після виконання гель-електрофорезу необхідно:
1) візуалізувати білкові плями за допомогою барвників;
2) проаналізувати електрофореграму щодо кількості білкових плям та їхнього розташування;
3) вирізати з гелю потрібні частини, які містять індивідуальні білкові плями;
4) виконати розщеплення індивідуальних білків протеазами (наприклад, трипсином – трипсинізація чи пепсином - пепсинізація) безпосередньо в вирізаній частині гелю.

2DE досі є сукупністю методів вибору для глобального аналізу і початкового профілювання різноманітних біологічних зразків для подальшого фракціонування та ідентифікації білків іншими технологіями з високою пропускною здатністю.

1. Merril CR, Switzer RC, Van Keuren ML (1979). Trace polypeptides in cellular extracts and human body fluids detected by two-dimensional electrophoresis and a highly sensitive silver stain. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4335-4339
2. Patton WF (2000). A thousand points of light: the application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics. Electrophoresis 21: 1123-1144
3. Dowlinga P., Palmerinic V., Henryb M., Meleadyb P., Lynchb V., Ballotd J., Gullod G., Crownd J., Moriartyb M., Clynesb M. (2014). Transferrin-bound proteins as potential biomarkers for advanced breast cancer patients. BBA Clinical 2: 24–30
4. O’Farrell PH (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem. 250: 4007–4021
5. Lopez MF (1999). 2-D electrophoresis using carrier ampholytes in the first
dimension (IEF). Methods Mol Biol 112: 111-127
6. Unlü M, Morgan ME, Minden JS (1997). Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071-2077
7. Marouga R, David S, Hawkins E. (2005). The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem 382(3):669-78
8. Kondo T, Hirohashi S (2009). Application of 2D-DIGE in cancer proteomics toward personalized medicine. Methods Mol Biol 577:135-154
9. Остерман ЛА (1981). Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука,. 288 с
10. Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. (1986). Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с анг. – М.: Мир,. – 448 с., ил.

Останнє редагування Середа, 07 грудня 2016 18:34
Ви тут: Home