Верифікація

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Сьогодні: 18.11.2017

Верифікація

(1 Голосувати)

Методи верифікації та валідації результатів протеомних досліджень

Суть валідації полягає у виокремленні із пулу ідентифікованих білків релевантних онкологічних маркерів для застосування в клініці з метою поліпшення якості життя пацієнтів із злоякісними новоутвореннями, тому, значення етапу підтвердження результатів досліджень важко переоцінити. Верифікація та валідація результатів експериментальних робіт є обов’язковим етапом, що виконується на значній кількості матеріалу за допомогою загально визнаних методів, переважно на основі застосування антитіл. Використовуються три групи методів: на основі IHC, на основі TMA, на основі MS (SRM/MRM-MS), що мають свої переваги та недоліки [1]. Набуває широкого застосування комбінована група методів валідації IHC/TMA [2-4], оскільки вони дозволяють аналізувати зразки тканини більшого розміру в порівнянні з класичним TMA [1]. Поширеними є Western blot [5,6] та MRM-MS [5, 7] та менш вживаними є SRM-MS [8], mTRAQ-SRM MS [2], IHC [9], RPPA [10] і ELISA [11]. Спостерігається тенденція до застосування декількох методів валідації в одному дослідженні з метою підвищення ефективності визначення достовірності отриманих результатів (Western blot + MRM-MS [5], mTRAQ-SRM MS + IHC/TMA [2], Western blot + IHC [6] – Табл.). Варто відмітити застосування RPPA у якості методу валідації під час проведення протеомного мета-аналізу пухлинних тканин молочної залози (n = 712) з метою визначення панелі предиктивних біомаркерів ([10], Табл.). Набуває поширення використання програмного забезпечення для верифікації та валідації результатів досліджень [12-14]. Результати досліджень протеому, які успішно пройшли стадію валідації, застосовуються у якості клінічно значущих біомаркерів для діагностики, прогнозу та терапії РМЗ [2-4, 6, 9-11].

Таблиця. Сучасні верифіковані протеомні біомаркери РГЗ. 

Об’єкт

дослідження

Методи дослідження

Методи валідації

Білок(и)

Клінічне

застосуван

ня

Поси

лан

ня

Інвазивні об’єкти

Пухлинні

тканини інвазивної протокової карциноми


Люмінальний B HER2+ve підтип

2D-PAGE

(SDS-PAGE),

2D-DIGE,

iTRAQ-MD-LC-MS/MS

(MD-LC (SCX-LC), MALDI-TOF/TOF MS)

Western blotting

MRM-MS

Apolipoprotein A1 (APOA1);

Gelsolin (GELS);

Heat shock protein HSP 90-beta (hs90b);

Eukaryotic elongation factor 1 alpha (EF1A1); Peroxiredoxin 3 (PRDX3); NHRF1.

Білкові біомаркери раку молочної залози


Класифікація молекулярних підтипів пухлин,

діагностика ранніх і пізніх стадій


Прогнозуван

ня результатів лікування (предиктивні біомаркери)

[5]

Пухлинні тканини інвазивної протокової карциноми


HER2 підтип

2D-PAGE

(SDS-PAGE),

2D-DIGE,

iTRAQ-MD-LC-MS/MS

(MD-LC (SCX-LC), MALDI-TOF/TOF MS)

Western blotting

MRM-MS

Peroxiredoxin 1 (PRDX1); Oxidoreductase (catD); Calreticulin (CALR);

ATPase beta chain (atpB); SOX14 (CH60)

SRY-box 14

Білкові біомаркери раку молочної залози


Класифікація молекулярних підтипів пухлин,

діагностика ранніх і пізніх стадій


Прогнозуван

ня результатів лікування (предиктивні біомаркери)

[5]

Пухлинні тканини інвазивної протокової карциноми


Ранні стадії пухлинної прогресії

2D-PAGE

(SDS-PAGE),

2D-DIGE,

iTRAQ-MD-LC-MS/MS

(MD-LC (SCX-LC), MALDI-TOF/TOF MS)

Western blotting

MRM-MS

Tropomyosin 4 (TPM4); Oxidoreductase (catD); Peroxiredoxin 3 (PRDX3); Annexin A3 (ANXA3);

Heat shock protein family B (small) member 1 (HSPB1).

Білкові біомаркери раку молочної залози


Класифікація молекулярних підтипів пухлин,

діагностика ранніх і пізніх стадій


Прогнозуван

ня результатів лікування (предиктивні біомаркери)

[5]

Пухлинні тканини інвазивної протокової карциноми


Пізні стадії пухлинної прогресії

2D-PAGE

(SDS-PAGE),

2D-DIGE,

iTRAQ-MD-LC-MS/MS

(MD-LC (SCX-LC), MALDI-TOF/TOF MS)

Western blotting

MRM-MS

Calreticulin (CALR); Ovotransferrin-like (TRFE); Gelsolin (GELS);

SOX14 (CH60) SRY-box 14;

Capping actin protein, gelsolin like (CAPG);

Ywhag (1433G) tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein gamma;

Glucose regulated protein 78 (grp78);

NHRF1

Білкові біомаркери раку молочної залози


Класифікація молекулярних підтипів пухлин,

діагностика ранніх і пізніх стадій


Прогнозуван

ня результатів лікування (предиктивні біомаркери)

[5]

Позитивні лімфовузли в порівняні з негативними первинного раку молочної залози

2D-PAGE

(SDS-PAGE)

qPCR (transcript level),

iTRAQ-2D-LC-MS/MS,

mTRAQ-SRM MS,

IHC/TMA

Transgelin (TAGLN)

Біомаркер метастазуван

ня в в лімфатичні вузли, асоційовані з раком молочної залози

[2]

Тканини первинної карциноми молочної залози у пацієнтів зі різним статусом лімфатичних вузлів

iTRAQ-2D-LC-MS/MS

mTRAQ-SRM MS, IHC/TMA

Transgelin (TAGLN); Transgelin-2 (TAGLN2)

Біомаркери метастазуван

ня в лімфатичні вузли, асоційовані з раком молочної залози

[2]

Тканини протокової карциноми молочної залози

Опубліковані дані і бази даних

(рівень mRNA)

IHC/TMA

Kinesin associated protein 3 (KIFAP3)

Біомаркер раку молочної залози

[3]

Метатстатичний рак молочної залози (пухлинна тканина)

Опубліковані дані і бази даних

(рівень mRNA)

IHC/TMA

Ribosome binding protein 1 (RRBP1)

Біомаркер інвазивних карценом молочної залози

[4]

Пухлинні тканини молочної залози


HER2+ підтип

LC-MS/MS

(SELDI MS)

IHC

KRT19 (CK19) keratin 19

Біомаркер HER2+ пухлин;


Предиктивний біомаркер

ER-/PR-/HER2- підтипу

[9]

Пухлинні тканини молочної залози


ER-/PR-/HER2- підтип

LC-MS/MS

(SELDI MS)

IHC

RNA-binding Ras-GAP SH3 binding protein (G3BP)

Біомаркер, що корелює з пухлинною прогресією і метастазуван

ням

[9]

Здорові тканини молочної залози та злоякісні пухлини

LC-MS/MS з ізотопним розведенням

SRM-MS

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1

(APE1)

Розробка інгібіторів APE1 як протиракових лікарських засобів;


Може мати прогностичне і предиктивне значення під час лікування раку

[8]

Тканини раку молочної залози з різними ER, PR і HER2 статусами

(Мета-аналіз)

Опубліковані дані по білкам в якості важливих цілей і протеомних процесів при раку молочної залози

RPPA

Estrogen receptor; Progesteron Receptor; Apoptosis regulator (BCL2); GATA binding protein 3 (GATA3);

KIAA1324 (EIG121); Epidermal growth factor receptor (EGFR);

Erb–b2 receptor tyrosine kinase 2 (HER2); HER2p1248;

Cyclin B1 (CCNB1);

Cyclin E1 (CCNE1)

Панель з 10-ти білкових предиктивних біомаркерів для класифікації раку молочної залози і прогнозу

[10]

Неінвазивні об’єкти

Сироватка

(пацієнти з рецидивами раку молочної залози і пацієнти без ознак рецидиву впродовж 5 років після встановлення діагнозу)

Лектинова афінна хроматографія,

2D-DIGE,

LC-MS/MS (RP-LC);

ELISA

CDH5 (CADHERIN5) cadherin 5, type 2 (vascular endothelium)

Предиктивний та діагностичний біомаркер

[11]

Плазма крові

(Здорових донорів і пацієнтів хворих на рак молочної залози)

LC-MS/MS

(RP-LC, ESI MS,

XCT II MS

(TripleQ MS)

MRM-MS

Apolipoprotein A1 (APOA1);

Hemopexin hemopexin-like;

Angiotensin preprotein

Кандидат в біомаркери раку молочної залози

[7]

Комбіновані об’єкти

Сеча і пухлини (ідентифікація)


LC-MS/MS (RP-LC)

 

Extracellular matrix

protein 1 (ECM1);

FLG2 (FILAGGRIN) filaggrin family member 2; Microtubule associated serine/threonine kinase family member 4 (MAST4);

Скринінг, моніторинг пухлинної прогресії

[6]

Клітинні лінії (валідація)

 

Western blotting

Extracellular matrix

protein 1 (ECM1);

FLG2 (FILAGGRIN) filaggrin family member 2; Microtubule associated serine/threonine kinase family member 4 (MAST4);

Пухлинна тканина

(валідація)

 

IHC, Western blotting

Microtubule associated serine/threonine kinase family member 4 (MAST4)

 

 

Скорочення до таблиці:

РГЗ - рак грудної залози

2D-PAGE(SDS-PAGE) — two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (sodium dodecyl sulphate) (метод двовимірного поліакриламідного гель-електрофорезу з застосуванням додецил сульфата натрія;

2D-DIGE — two-dimensional differential in-gel electrophoresis (двовимірний диференційний електрофорез в гелі);

MD-LC — Multidimensional Liquid Chromatography (багатовимірна рідинна хроматографія);

SCX-LC — Strong Cation-Exchange Liquid Chromatography (сильна катіон-обмінна рідинна хроматографія);

RP-LC — Reversed Phase Liquid Chromatography (рідинна хроматографія з оберненою фазою);

MS - Mass Spectrometry (мас-спектрометрія);

ESI MS — Electrospray Ionization Mass Spectrometry (джерело іонізації, яке готується шляхом розпилювання зразка за допомогою електроспрею);

SELDI MS — Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (джерело іонізації, основу якого становить поверхнево-підсилена лазерна десорбція/іонізація);

MALDI-TOF/TOF MS — комбінований метод мас-спектрометрії, основу якого складає джерело іонізації - Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry - MALDI (матрично-активована лазерна десорбція/іонізація) та подвійно під’єднані аналізатори іонів TOF/TOF MS - Time-Of-Flight/Time-Of-Flight analyzers (тандемний часпольотний аналізатор);

XCT II MS — тип мас-спектрометра з характеристиками методу TripleQ MS — Triple Quadrupoles analyzers (потрійно під’єднані квадропольні мас-аналізатори в мас-спектрометрії);

LC-MS/MS — liquid chromatography - tandem mass spectrometry (метод рідинної хроматографії, поєднаний з тандемною мас-спектрометрією);

iTRAQ-MD-LC-MS/MS — isobaric tags for relative and absolute quantification - multidimensional liquid chromatography - tandem mass spectrometry (метод з застосуванням ізобарних міток для відносної і абсолютної квантифікації в комбінації з багатовимірною рідинною хроматографією, поєднаною з тандемною мас-спектрометрією;

ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay (імуноферментний аналіз);

IHC — immunohistochemical analysis (імуногістохімічний аналіз);

IHC/TMA — immunohistochemistry on tissue microarrays (імуногістохімічний аналіз на тканинних мікрочіпах);

iTRAQ-2D-LC-MS/MS — isobaric tags for relative and absolute quantification - two-dimensional - liquid chromatography - tandem mass spectrometry (ізобарні мітки для відносної і абсолютної квантифікації в комбінації з двовимірною рідинною хроматографією, поєднаною з тандемною мас-спектрометрією);

MRM-MS — multiple reaction monitoring mass spectrometry (множинний реакційний моніторинг в мас-спектрометрії);

mTRAQ-SRM MS — mass differential tags for relative and absolute quantification of selective reaction monitoring mass spectrometry (мас-диференціальні теги для відносної і абсолютної квантифікації в комбінації з селективним реакційним моніторингом в мас-спектрометрії);

qPCR — quantitativereal-time polymerase chain reaction (кількісна полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі);

RPPA — reversed phase protein array (реверс фазний метод белкових матриць);

SRM-MS — selective reaction monitoring mass spectrometry (селективний реакційний моніторинг в мас-спектрометрії);

Western blot — вестерн блот

Таким чином, аналіз літературних джерел щодо протеому РМЗ вказує на важливу роль стратегій top-down та bottom-up як основних в дослідженнях протеомних біомаркерів РМЗ із залученням LC–MS/MS. Прогрес технологій зосереджений на розширенні застосування спектру елементарних методів LC та MS в рамках комбінованого методу LC–MS/MS. Дослідження протеому РМЗ проводиться в напрямках профілювання різноманітного біологічного матеріалу з метою поліпшення профілактики, скринінгу, діагностики, прогнозу та терапії. Ідентифіковано значний пул білків пухлин молочної залози та білків рідин, асоційованих з РМЗ, частина з яких була валідована. Прогрес методів валідації сприяє застосуванню перевірених біомаркерів РМЗ у якості клінічно значущих. Загалом, результати протеомних досліджень демонструють інтегровану взаємодію даних та ресурсів “omics” з системним підходом до оцінки функцій компонентів біологічних процесів при патологічних змінах в організмі, зокрема РМЗ.

1. Gromov P, Moreira JMA, Gromova I. Proteomic analysis of tissue samples in translational breast cancer research. Expert Rev Proteomics 2014; 11: 285-302.

2. Dvořáková M, Jeřábková J, Procházková I, et al. Transgelin is upregulated in stromal cells of lymph node positive breast cancer. J Proteomics 2016; 132:103-111. 

3. Telikicherla D, Maharudraiah J, Pawar H, et al. Оverexpression of kinesin associated protein 3 (KIFAP3) in breast cancer. J Proteomics Bioinform 2012; 5: 122-126.

4. Telikicherla D, Marimuthu A, Kashyap MK, et al. Overexpression of ribosome binding protein 1 (RRBP1) in breast cancer. Clin Proteomics 2012; 9: 7.

5. Pendharkar N, Gajbhiye A, Taunk K, et al. Quantitative tissue proteomic investigation of invasive ductal carcinoma of breast with luminal B HER2 positive and HER2 enriched subtypes towards potential diagnostic and therapeutic biomarkers. J Proteomics 2016; 132: 112-130.

6. Beretov J, Wasinger VC, Millar EK, et al. Proteomic analysis of urine to identify breast cancer biomarker candidates using a label-free LC-MS/MS approach. PLoS One 2015; 10: e0141876.

7. Riley CP, Zhang X, Nakshatei H, et al. A large, consistent plasma proteomics data set from prospectively collected breast cancer patient and healthy volunteer samples. J Transl Med 2011; 9: 80.

8. Coskun E, Jaruga P, Reddy PT, et al. Extreme Expression of DNA Repair Protein Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease 1 (APE1) in Human Breast Cancer As Measured by Liquid Chromatography and Isotope Dilution Tandem Mass Spectrometry. Biochemistry 2015 , 54: 5787-5790.

9. He J, Whelan SA, Lu M, et al. Proteomic-based biosignatures in breast cancer classification and prediction of therapeutic response. Int J Proteomics 2011; 2011: 1-16.

10. Gonzalez-Angulo AM, Hennessy BT, Meric-Bernstam F, et al. Functional proteomics can define prognosis and predict pathologic complete response in patients with breast cancer. Clin Proteomics 2011; 8: 11.

11. Fry SA, Sinclair J, Timms JF, et al. A targeted glycoproteomic approach identifies cadherin-5 as a novel biomarker of metastatic breast cancer. Cancer Lett 2013; 328: 335–344.

12. Tyanova S, Albrechtsen R, Kronqvist P, et al. Proteomic maps of breast cancer subtypes. Nat Commun 2016; 7: 10259.

13. Ntai I, LeDuc RD, Fellers RT, et al. Integrated bottom-up and top-down proteomics of patient-derived breast tumor xenografts. Mol Cell Proteomics 2016; 15: 45-56.

14. Xu Z, Wu C, Xie F, et al. Comprehensive quantitative analysis of ovarian and breast cancer tumor peptidomes. J Proteome Res 2014; 14: 422-433.

Останнє редагування Понеділок, 26 грудня 2016 10:42
Ви тут: Home