Протеомні технології

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Сьогодні: 26.09.2017
Протеомні технології

Протеомні технології 3

proteomni tehnologii.jpgСучасне різноманіття технічних рішень сприяє розробці оптимальних стратегій і підходів до ідентифікації білків, що дозволяє виконувати найдетальніший аналіз протеому тканин і рідин організму людини. Є різні способи класифікації таких методів. Так, автори [1] протеомні методи дослідження поділяють на такі, що мають принцип дії на основі використання антитіл (antibody-based proteomic approaches), та ті, що мають принцип дії без використання антитіл (nonantibody-based proteomic approaches). До них належать методи:

  • antibody-based proteomic approaches:Western blot , ELISA, IHC, TMA та RPPA, які знайшли своє застосування для верифікації та валідації отриманих даних для впровадження результатів у клінічну практику і потребують попередніх знань про білки, що досліджуються за допомогою цих методів;
  • nonantibody-based proteomic approaches:технології на основі мас-спектрометрії (MS), застосовуються як дослідні платформи для отримання масивів даних ідентифікованих білків.

Інші дослідники [2] за типом використаного обладнання виділяють наступні протеомні підходи:

1. Підходи на основі гель-методів (gel-based proteomics approaches): 1D-PAGE, 2D gel (2D-PAGE та 2D-DIGE)

2. Пептид-орієнтована протеоміка (peptide-centric proteomics approaches): методи на основі мас-спектрометрії (MS-based proteomics approach: LCMS/MS, MS/MS, ICATLCMS/MS, iTRAQLCMS/MS)

3. Підходи на основі матриць (array-based proteomics approaches): RPPA, TMA-based tissue assays – методи засновані на аналізі тканинних мікрочипів

Yates з колегами [3] детально розглядає декілька стратегій до профілювання білків («bottom-up analysis» та «top-down analysis»), які принципово різняться між собою початковим етапом підготовки зразків для протеомного аналізу і використовуються для виконання методів на основі гель-електрофорезу, рідинної хроматографії та мас-спектрометрії. Підхід «bottom-up analysis» (аналіз знизу-вгору) [4-6] полягає у використанні попереднього ферментативного розщеплення білкових молекул на пептиди. Застосовується для:

1) пошуку білків у базах даних завдяки пептидному аналізу з метою ідентифікації білків
2) хімічної модифікації пептидів з метою пептидної і білкової квантифікації

 

pic 3.1

Мал. 1. Принципи та методи, які використовують у сучасних протеомних
             дослідженнях раку грудної залози. Адаптовано з [2]
             1 – аналіз тканин та підготовка проб
             2 – протеомні технології
             3 – верифікація даних
             4 – валідація даних в клініці

Переваги підходу такі:
1) дозволяє аналізувати білкові зразки високої складності
2) придатний до набору значного масиву даних
3) краще працює при фронтальному розділенні пептидів
4) має вищу чутливість порівняно з top-down analysis
5) має широкий вибір технічних інструментів для аналізу пептидів.

Недоліками стратегії є:
1) обмежена зона послідовності білкових молекул для аналізу пептидів
2) вузький діапазон мас, що підлягають аналізу, у випадку використання мас-спектрометрії як інструменту цієї стратегії
3) вимагає деякої кількості повторних аналізів зразків з великим різноманіттям пептидів
4) не має прямого доступу до аналізу мас інтактних білків;
5) у процесі виконання підходу втрачаються лабільні білки з посттрансляційними модифікаціями
6) неможливо встановити приналежність надлишкових пептидних послідовностей.

У свою чергу, «top-down analysis» (аналіз зверху-вниз) [7-10] полягає в інтактному приготуванні препаратів (без пошкодження та розщеплення молекул білків) для їх аналізу. Застосовується для:
1. Аналізу окремих білків і простих білкових сумішей
2. Аналізу комплексів білок-білок та білків-мішеней
3. Множинної ідентифікації білків з посттрансляційними модифікаціями (фосфопротеомний аналіз).

Переваги стратегії такі:
1. Достатньо велика зона послідовності білкових молекул, яка використовується в процесі аналізу і дозволяє ідентифікувати ізоформи білків.
2. М’яка фрагментація білків за допомогою методів дисоціації ECD [11] та ETD [12, 13] дозволяє зберігати лабільні білки з посттрансляційними модифікаціями.
3. Краща квантифікація білків у порівнянні з bottom-up analysis.

Недоліки підходу наступні:

1. Обмеження у використанні попередників заряджених іонів та складність аналізу білків з неоднозначним статусом заряду.
2. Обмеження під час використання методів розділення – фронтальне розділення білків у цьому випадку більш складніше.
3. Низька чутливість під час ідентифікації білків.

Методологічні інструменти застосування обох стратегій різноманітні. Певними авторами [14] для прикладу наводяться наступні:

  • bottom-up methods – методи гель електрофорезу, методи афінної хроматографії (ICAT в тому числі), методи іоно-обмінної хроматографії, RP-LC, Q-TOF MS, LTQ-Orbitrap MS тощо
  • top-down methods – методи іоно-обмінної хроматографії, RP-LC, 2D-LC, ESI MS, LTQ-Orbitrap MS тощо.

При цьому деякі з методів можуть вдало одночасно використовувались для виконання обох стратегій у різних наукових роботах (наприклад, RP-LC та LTQ-Orbitrap MS).

Загалом, у більшості сучасних протеомних досліджень використовують поєднання методів гель-електрофорезу та хроматографії з методами мас-спектрометрії. Гель-електрофорез і хроматографію застосовують для розділення білкової суміші на вузько специфічні фракції, що містять невеликі групи білків, подібні між собою за певною фізико-хімічною характеристикою. З отриманих фракцій обирають одну або декілька у якості дослідних, і далі аналізують за допомогою методів мас-спектрометрії, ідентифікуючи по декілька тисяч білків в одному зразку. Під час використання мас-спектрометра застосовується деяка особливість сканування зразків: інформація, отримана в результаті першого сканування, вибірково використовується за наступних сканувань, почергово деталізуючи дані про білкові пептиди дослідного зразка. Крім того, широко застосовуються складні комбіновані методи, які поєднують у собі декілька послідовних розділень за допомогою елементарних методів рідинної хроматографії (наприклад, метод SCX-RP-LC [15]) та ідентифікацію, в результаті використання декількох послідовних елементарних методів мас-спектрометрії (наприклад, метод LC-MS/MS [16-19.]).

Загальна схема проведення експерименту. Розпочинаючи кожне з експериментальних досліджень, вчені дотримуються наступної схеми дій:

1) аналізують сучасну наукову літературу на предмет актуальних напрямків досліджень
2) розробляють дизайн експерименту:
а) визначають мету та формують робочу гіпотезу, яку мають підтвердити чи спростувати отримані експериментальні дані
б) визначають поетапні завдання дослідження, що допоможуть досягти мети
с) визначаються з методами дослідження
д) обирають систему внутрішніх стандартів для кожного з методів дослідження
е) обирають коректні контрольні та дослідні групи зразків
3) створюють календарний план та переходять до його виконання.

У дослідженнях протеому використовують аналіз великої кількості однотипових зразків. Для цього в переважній більшості експериментів виконують такий алгоритм дій:

1. Відбирають матеріал для дослідних зразків: клітини, тканини та фізіологічні рідини організму. Це може бути матеріал тканин молочної залози (біопсійний, післяопераційний, отриманий за допомогою методу LCM, клітини експериментальних моделей РМЗ, дослідний пухлинний матеріал in vivo) та біологічні рідини (післяопераційна сироватка, пухлинна міжклітинна рідина, сироватка та плазма крові, мононуклеарні клітини, цереброспінальна рідина, сеча, слина, молоко, аспірат із сосків, рідини з органів та порожнин тіла) [20-29].
2. Готують дослідні зразки. Використовуючи спеціальні протоколи, лізують клітини та екстрагують з матеріалу білкову фракцію.
3. Застосовують або опускають стадію протеолітичного розщеплення білкових молекул в отриманому дослідному зразку перед чи після виконання методів розділення суміші на фракції (відповідно до стратегій «bottom-up analysis» чи «top-down analysis»).
4. Виділяють групу білків із загальної білкової суміші за допомогою гель-електрофорезу або ж хроматографії для їхньої ідентифікації іншими технологіями, що характеризуються кращою роздільною здатністю, а отже і більшою ефективністю отримання результатів.
5. Проводять мас-спектрометричний аналіз амінокислотних послідовностей фрагментів індивідуальних протеїнів із дослідної групи білків.
6. Аналізують результати, використовуючи методи in silico. Методи біоінформатики дають змогу ідентифікувати індивідуальні білки, отримати диференціальний профіль білків, проаналізувати бази даних та побудувати мережі білкових асоціацій і взаємодій.
7. Використовуючи протеомні методи-стандарти, виконують верифікацію результатів дослідження (наприклад, вестерн блот та імуногістохімічний аналіз) і валідацію результатів дослідження (наприклад, ELISA та TMA) відносно їхнього застосування в клінічній практиці.
8. Виконують статистичну обробку даних дослідження.
9. Оформлюють задокументовані результати дослідження в наукову статтю та публікують її у фахових періодичних виданнях.
10. Результати досліджень, що демонструють вагомий внесок та переваги для пацієнтів, впроваджують у клінічну практику.

Типову схему протеомних досліджень РМЗ наведено на малюнку 1.

Розглянемо детальніше принципи та застосування методів, які використовують у сучасних протеомних дослідженнях РМЗ.

1. Chae YK., Gonzalez-Angulo А (2014). Implications of Functional Proteomics in Breast Cancer.TheOncologist 19:328–335.
2. Gromov P, Moreira Jose´ MA, Gromova I (2014). Proteomic analysis of tissue samples in translational breast cancer research Expert Rev. Proteomics 11(3): 285–302. 
3. Yates JR, Ruse CI, Nakorchevsky A (2009). Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances and applications. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11:49-79.
4. McDonald WH, Yates JR 3rd (2002). Shotgun proteomics and biomarker discovery. Dis. Markers 18:99–105.
5. McDonald WH, Yates JR 3rd. (2003). Shotgun proteomics: integrating technologies to answer biological questions. Curr. Opin. Mol. Ther. 5:302–309.
6. Chait BT (2006). Chemistry. Mass spectrometry: bottom-up or top-down? Science 314:65–66
7. Breuker K, Jin M, Han X, Jiang H, McLafferty FW (2008). Top-down identification and characterization of biomolecules by mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19:1045–53. 
8. McLafferty FW, Fridriksson EK, Horn DM, Lewis MA, Zubarev RA (1999). Techview: biochemistry. Biomolecule mass spectrometry. Science 284:1289–90.
9. McLafferty FW, Horn DM, Breuker K, Ge Y, Lewis MA, et al (2001). Electron capture dissociation of gaseous multiply charged ions by Fourier-transform ion cyclotron resonance. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12:245–49
10. Reid GE, McLuckey SA (2002). ‘Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 37:663–75
11. Zubarev RA, Kelleher NL, McLafferty FW (1998). Electron capture dissociation of multiply charged protein cations. A nonergodic process. J. Am. Chem. Soc. 120:3265–66.
12. Syka JE, Coon JJ, Schroeder MJ, Shabanowitz J, Hunt DF (2004). Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9528–33
13. Coon JJ, Ueberheide B, Syka JE, Dryhurst DD, Ausio J, et al (2005). Protein identification using sequential ion/ion reactions and tandem mass spectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:9463–68
14. Yates R, Ruse CI, Nakorchevsky A (2009). Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances and applications. Annu. Rev. Biomed. Eng.11:49-79.
15. Yang F,  Shen Yu,  Camp DG, II,   Smith RD. (2012). High pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation as an alternative to strong-cation exchange chromatography for two-dimensional proteomic analysis. Expert Rev Proteomics 9(2): 129–134.
16. Zhang F, Wang M, Michael T, Drabier R (2013). Novel alternative splicing isoform biomarkers identification from high-throughput plasma proteomics profiling of breast cancer. BMC Systems Biology, 7(Suppl 5):S8
17. Zhang F, Deng Y, Wang M, Cui L, Drabier R (2014). Pathway-based Biomarkers for Breast Cancer in Proteomics. Cancer Informatics:13(S5) 101–108.
18. Dowlinga P, Palmerinic V, Henryb M, Meleadyb P, et al (2014) Transferrin-bound proteins as potential biomarkers for advanced breast cancer patients. BBA Clinical 2:24–30. 
19. Xu Z, C Wu, F Xie, GW Slysz, et al (2015). Comprehensive Quantitative Analysis of Ovarian and Breast Cancer Tumor Peptidomes. Journal of Proteome Research 14(1):422-433.  
20. Morrison C, Mancini S, Cipollone J, Kappelhoff R, Roskelley C, Overall C (2011). Microarray and proteomic analysis of breast cancer cell and osteoblast co-cultures. J. Biol. Chem. 286, 39: 34271–34285.
21. Drake RR, Cazares LH, Jones EE, Fuller TW, Semmes OJ,et al (20110/ Challenges to Developing Proteomic-Based Breast Cancer Diagnostics. OMICS A Journal of Integrative Biology Volume 15, 5: 251-259.
22. Gromov P , Moreira J MA, Gromova I (2014). Proteomic analysis of tissue samples in translational breast cancer research Expert Rev. Proteomics 11(3), 285–302.
23. Al-Tarawneh SK, Border MB., Dibble CF, Bencharit S (2011). Defining Salivary Biomarkers Using Mass Spectrometry-Based Proteomics: A Systematic Review. OMICS A Journal of Integrative Biology 15, (6):1-9
24. Aslebagh R, Ngounou A, Channaveerappa D,  Arcaro K, Darie C (2015) Proteomics Study of Human Breast Milk for Breast Cancer Biomarkers Discovery. The FASEB Journal 29 (1) Supplement 567.26
25. Beretov J, Wasinger VC, Millar EKA, Schwartz P, Graham PH, Li Y (2015). Proteomic Analysis of Urine to Identify Breast Cancer Biomarker Candidates Using a Label-Free LC-MS/MS Approach. PLoS ONE 10(11): e0141876
26. Di Luca A., Henry M, Meleady P, O’Connor R (2015). Label-free LC-MS analysis of HER2+ breast cancer cell line response to HER2 inhibitor treatment. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences 23(40):1-13
27. Fry SA, Afrough B, Lomax-Browne HJ, Timms JF, Velentzis LS, Leathem A. JC (2011). Lectin microarray profiling of metastatic breast cancers. Glycobiology 21 (8):1060–1070.
28. Gast M.-CW, Zapatka M, van Tinteren H, Bontenbal M, et al (2011).Postoperative serum proteomic profiles may predict recurrencefree survival in high-risk primary breast cancer. J Cancer Res Clin Oncol 137:1773–1783
29. Khadir A, Tiss A (2013) Proteomics Approaches towards Early Detection and Diagnosis of Cancer. J Carcinogene Mutagene S14: 002

 


Методи мас-спектрометрії

В онкології, а саме у випадку РМЗ, мас-спектрометрія застосовується для діагностики, тераностики, дослідження різноманітних прогностичних факторів РМЗ, дослідження факторів метастазування, аналізу ефективності терапевтичних препаратів (цитотоксичність речовин) та причин резистентності пухлин.

Останнє редагування Понеділок, 29 серпня 2016

Методи хроматографії

Хроматографія – це процес розділення суміші речовин на окремі компоненти за допомогою системи, що складається з двох фаз, які, в свою чергу, не змішуються між собою.

Останнє редагування Вівторок, 23 серпня 2016

Методи білкового гель-електрофорезу

Біологічні зразки піддають обробці з використанням спеціальних протоколів з метою виділення білкової фракції. Отримані препарати з широким спектром білків перед аналізом збагачують та фракціонують, що зумовлено особливостями їхньої структури. Для гель-електрофорезу найчастіше застосовують підходи до розділення білків, що ґрунтуються на розмірі білків або їх фізико-хімічних властивостях.

Останнє редагування Середа, 07 грудня 2016
Ви тут: Home Протеомні технології