Комплексні молекулярні портрети пухлин грудної залози людини

Науково-освітній інтернет-портал ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України

Первинна профілактика, діагностика і лікування хворих на рак молочної залози

Комплексні молекулярні портрети пухлин грудної залози людини

(0 голосів)

Комплексні молекулярні портрети пухлин грудної залози людини

Мережа «Атлас геному раку»

Ми проаналізували первинні пухлини молочної залози методами масивів числа геномних копій ДНК, метилювання ДНК, секвенування екзому, масивів матричної РНК, секвенування мікроРНК і білкових масивів із оберненою фазою. Завдяки нашій можливості інтегрувати інформацію, отриману на різних платформах, вдалося заглибитися в суть раніше визначених підтипів експресії генів і довести існування чотирьох основних класів раку молочної залози. При цьому були об'єднані дані з п'яти платформ, кожна з яких виявляє значну молекулярну гетерогенність. Соматичні мутації в лише трьох генах (TP53, PIK3CA і GATA3) мають місце з частотою > 0,10% у всіх випадках раку молочної залози, однак існують численні асоційовані з підтипами і нові генні мутації, включаючи збагачення специфічних мутацій в GATA3, PIK3CA і MAP3K1 при підтипі люмінальних пухлин. Ми ідентифікували дві підгрупи, що визначаються на підставі експресії нових білків, які, можливо, виробляються стромальними елементами/мікрооточенням, і за допомогою комплексного аналізу ідентифікували специфічні сигнальні шляхи, що домінують при кожному молекулярному підтипі, включаючи HER2/фосфорильований HER2/EGFR/фосфорильований EGFR підпис у межах HER2-збагаченого підтипу експресії. Порівняння базальноподібних пухлин молочної залози з високодиференційованими серозними пухлинами яєчників продемонстувало багато молекулярних подібностей, що вказує на спорідненість етіології і схожі терапевтичні можливості. Завдяки тому, що вдалося біологічно визначити чотири основні підтипи раку молочної залози, викликані різними підмножинами генетичних і епігенетичних порушень, була висунута гіпотеза про те, що більша частина пластичності і неоднорідності, що спостерігається на клінічному рівні, має місце в межах цих основних біологічних підтипів раку молочної залози, а не між ними.

Рак молочної залози є одним з найпоширеніших видів раку: у світі відзначаються понад 1 300 000 випадків і 450 тисяч смертей на рік. Клінічно це гетерогенне захворювання розділяють на три основні терапевтичні групи. Група, що є позитивною щодо рецептора естрогену (ER), є найчисленнішою і найрізноманітнішою. Є кілька геномних тестів, що допомагають передбачити результати для пацієнтів з ER+, які отримують гормональну терапію (1,2). Виділення групи з ампліфікацією HER2 (також званої ERBB2) (3) стало значним клінічним успіхом, оскільки дозволило ефективне націлення терапії на HER2, що спрямувало інтенсивні зусилля на те, щоб охарактеризувати інші аберації за кількістю копій ДНК (4,5). «Потрійний негативний рак» молочної залози (TNBC, при якому відсутня експресія ER, рецептора прогестерону (PR) і HER2), також відомий як базальноподібний рак молочної залози (6), являє собою групу, де єдиним варіантом лікування є хіміотерапія. Він найчастіше зустрічається у пацієнтів з генеративною мутацією BRCA1 (7,8) або осіб африканського походження (9).

Більшість молекулярних досліджень раку молочної залози були зосереджені тільки на одній або двох платформах із високим вмістом інформації; найчастіше йшлося про визначення профілю експресії мРНК або про аналіз числа копій ДНК, а останнім часом набуло пощирення масивно-паралельне розпізнавальне секвенування (10-12). Шляхом контрольованої кластеризації даних щодо експресії мРНК було встановлено, що рак молочної залози поєднує кілька різних захворювань, які часто називають внутрішніми підтипами раку молочної залози (13,14). Останнім часом були розроблені високоінформативні додаткові методи аналізу, сфокусовані на аномаліях в метилюванні ДНК, експресії мікроРНК (міРНК) і експресії білків, що створюють додаткові можливості того, щоб повніше охарактеризувати молекулярну архітектуру раку молочної залози. У цьому дослідженні був проаналізований набір різноманітних пухлин молочної залози за допомогою шести різних технологічних платформ. Шляхом аналізу даних, отриманих за допомогою індивідуальних платформ, і комплексного аналізу сигнальних шляхів, було виявлено багато підтип-специфічних мутацій і змін кількості копій, які ідентифікують терапевтично значущі геномні аберації та інші явища, що визначають біологію пухлини.

Зразки та клінічні дані

Зразки пухлин і зразки генеративної ДНК були отримані від 825 хворих. Різні підгрупи пацієнтів аналізували на кожній іх платформ: 466 пухлини від 463 пацієнтів мали дані, наявні для п'яти платформ, включаючи мікрочипи для аналізу експресії мРНК Agilent (n = 547), чипи для аналізу метилювання ДНК Illumina Infinium (n = 802), масиви Affymetrix 6.0 для аналізу однонуклеотидного поліморфізму (SNP) (n =773), секвенування мікроРНК (n = 697) і секвенування всього екзому (n =507); крім того, для 348 із 466 зразків були в наявності також дані, отримані за допомогою білкових біочипів з оберненою фазою (RPPA) (n =403). У зв'язку з короткою медіаною загального подальшого спостереження (17 місяців) і невеликою загальною кількістю подій виживаності (93 з 818) аналіз виживаності буде представлений у пізнішій публікації. Демографічні та клінічні характеристики подані в Додатковій таблиці 1.

Істотно мутовані гени при раку молочної залози

У цілому 510 пухлин, отриманих від 507 пацієнтів, були піддані секвенуванню всього екзому, що ідентифікує 30 626 соматичних мутацій, які складаються з 28 319 точкових мутацій, 4 динуклеотидних мутацій і 2302 інсерцій/делецій (інделів) (від 1 до 53 нуклеотидів). Точкові мутації включали 6 486 мутацій у неструктурних генах, 19 045 міссенс-мутацій, 1 437 нонсенс-мутацій, 26 мутацій «read-through» [мутації, за яких РНК-полімераза не розпізнає стоп-кодон і зчитує до наступного стоп-кодону], 506 мутацій сайта сплайсингу і 819 мутацій в генах РНК. Шляхом порівняння з базами даних COSMIC та OMIM визначено 619 мутацій у 177 раніше описаних генах раку. Із 19 045 міссенс-мутацій 9 484, згідно з прогнозами Condel (15), мають високу ймовірність виявитися шкідливим. Пакет MuSiC (16), який визначає значущість спостережуваної частоти мутацій для кожного гена на основі частоти фонових мутацій, ідентифікував 35 істотно мутованих генів (за винятком ідентифікаторів генів LOC або Ensembl), за допомогою принаймні двох тестів (тест згортки і тест співвідношення правдоподібності), що мають показник помилкового виявлення (FDR) < 5% (Додаткова таблиця 2).

Крім визначення майже всіх генів, які раніше пов'язувалися з в раком молочної залози (PIK3CA, PTEN, AKT1, TP53, GATA3, CDH1, RB1, MLL3, MAP3K1 і CDKN1B), був ідентифікований ряд нових генів з високою частотою мутацій, у тому числі TBX3, RUNX1, CBFB, AFF2, PIK3R1, PTPN22, PTPRD, NF1, SF3B1 і CCND3. Ген TBX3, мутація в якому асоціюється з ульнарно-мамарним синдромом і який бере участь у розвитку молочної залози (17), має 13 мутацій (8 інделів зсуву рамки, 1 делеція всередині рамки зчитування, 1 нонсенс-мутація і 3 міссенс-мутації), що свідчить про втрату функції. Крім того, дві мутації були виявлені в гені TBX4 і 1 мутація в TBX5, які є генами, що беруть участь у розвитку синдрому Хольта-Орама (18). Два інших фактори транскрипції: CTCF і FOXA1 – також мають або потенційно можуть мати значення, бо вони нараховують 13 і 8 мутацій відповідно. Гени RUNX1 і CBFB, яким властиві перестановки при гострій мієлоїдній лейкемії і які перешкоджають диференціації в кровотворній системі, мають 19 і 9 мутацій відповідно. Ген PIK3R1 має 14 мутацій, більшість з яких зосереджені в домені взаємодії з PIK3CA, що аналогічно до раніше ідентифікованих мутацій при гліомі (19) і раку ендометрія (20). Ми також спостерігали статистично значущий патерн виключення серед мутацій генів PIK3R1, PIK3CA, PTEN і AKT1 (P = 0,025). Мутація фактора сплайсингу SF3B1, раніше описана при мієлодиспластичних синдромах (21) і хронічному лімфолейкозі (22), була значною: налічувалося 15 мутацій поза неструктурними генами, з яких 4 являли собою рекурентну заміну K700E. Два гени протеїн-тирозин-фосфатази (PTPN22 і PTPRD) були також значно мутованими; часті делеції/мутації у гені PTPRD спостерігаються при аденокарциномі легенів (23).

Мутації і асоціації підтипів експресії мРНК

Ми проаналізували спектр соматичних мутацій у контексті чотирьох підтипів експресії мРНК. Виняток склала група нормальноподібного підтипу через малу чисельність (n =8) (рис. 1). Кілька значно мутованих генів показали специфічні для підтипу мРНК (Додаткові мал. 1–3) та спефицічні для клінічного підтипу патерни мутацій (Додаткова табл. 2). Істотно мутовані гени були значно різноманітніші і частіше зустрічалися серед пухлин підтипів «люмінальний А» і «люмінальний B», ніж серед підтипів «базальноподібний» і «HER2-збагачений» (HER2E), однак загальна частота мутацій була найнижчою в підтипі «люмінальний А» і найвищою в підтипах «базальноподібний» і HER2E. Підтипу «люмінальний А» були властиві найбільш мутовані гени, серед яких найчастішими були мутації в генах PIK3CA (45%), далі йшли MAP3K1, GATA3, TP53, CDH1 і MAP2K4. Дванадцять відсотків пухлин підтипу «люмінальний A» мали мутації, що ймовірно призводять до інактивації, в генах MAP3K1 і MAP2K4, які представляють два суміжних кроки в сигнальному шляху р38-JNK1 стрес-кінази (24). Пухлинам підтипу «люмінальний B» притаманні значні мутації в різноманітних генах, при цьому мутації в генах TP53 і PIK3CA (по 29% кожний) є найбільш частими. Пухлини люмінальних підтипів помітно контрастують із базальнопідібним раком, де мутації TP53 мали місце у 80% випадків, а більша частина з репертуару значною мірою мутованих генів, за винятком PIK3CA (9%), була цілком чи майже повністю відсутня. Підтип HER2E, якому часто властива ампліфікація HER2 (80%), мав гібридний патерн із високою частотою мутацій у генах TP53 (72%) і PIK3CA (39%) і набагато нижчою частотою інших інтенсивно мутуючих генів, включаючи PIK3R1 (4%).

Внутрішні підтипи мРНК відрізнялися не лише за частотою, а й за типом їхніх мутацій. Зокрема, мутації в гені TP53 в базальноподібних пухлинах, як правило, були представлені нонсенс-мутаціями і мутаціями зсуву рамки зчитування, в той час як у пухлинах підтипів «люмінальний А» і «люмінальний B» переважали міссенс-мутації (Додатковий мал. 1). Було виявлено 58 соматичних мутацій у гені GATA3, частина з яких була раніше описана (25), в тому числі делеція 2 пар у «гарячій точці» в межах інтрону 4 – тільки в підтипі «люмінальний А» (13 з 13 мутантів) (Додатковий мал. 2). На відміну від цього, 7 з 9 мутацій зсуву рамки в екзоні 5 (домен зв'язування з ДНК) мали місце в пухлинах підтипу «люмінальний B». Частота і спектр мутацій у гені PIK3CA також варіювали залежно від підтипу мРНК (Додатковий мал. 3); рекурентна мутація в гені PIK3CA E545K була присутня майже виключно в пухлинах підтипу «люмінальний А» (25 з 27). Мутації в гені CDH1 були поширені (30 з 36) в глобулярному гістологічному підтипі, що відповідало зниженню мРНК CDH1 (Додатковий мал. 4) та експресії білка. Нарешті, ми ідентифікували 4 з 8 соматичних варіантів в підтипі HER2 лобулярного раку, три з яких були в домені тирозинкінази.

Ми провели аналіз на обраному наборі генів (26), використовуючи дані ДНК нормальної тканини і виявили цілу низку сприяючих генеративних варіантів. У цих аналізах були ідентифіковані 47 з 507 пацієнтів з шкідливими генеративними варіантами, що представляють дев'ять різних генів (ATM, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, NBN, PTEN, RAD51C і TP53; Додаткова табл. 3), що підтверджує гіпотезу про те, що 10% спорадичного раку молочної залози спроможні на значний генеративний внесок.

Ці дані підтвердили зв'язок між наявністю генеративної мутації BRCA1 зародкової лінії та базальноподібним раком молочної залози (7,8).

image001

Малюнок 1. Значно мутовані гени і кореляції з геномними і клінічними особливостями. Зразки пухлин згруповані за підтипами мРНК: підтип «люмінальний A» (n =225), «люмінальний B» (n = 126), HER2E (n = 57) і базальноподібний (n = 93). Ліва панель показує патерни немовчазних соматичних мутацій і частоти істотно мутованих генів. Середня панель показує клінічні особливості: темно-сірий колір – позитивний чи T2-4; білий – негативний або T1; світло-сірий – N/A або сумнівний результат.
N – стан вузла; Т – розмір пухлини. Права панель показує значно мутовані гени з частими ампліфікаціями кільості копій (червоний колір) або делеціями (синій колір). Крайня права панель показує частоту немовчазних мутацій у розрахунку на пухлину (мутації в розрахунку на мегабазу, скориговану на покриття). Вказана середня частота мутацій для кожного підтипу експресії. Гіпермутовані: частота мутацій > 3 стандартних відхилень вище середнього (> 4 688, позначені сірою лінією).

Аналіз експресії генів (мРНК і мікроРНК)

Для пошуку структури в даних по експресії мРНК було застосовано кілька підходів. Ми провели неконтрольований ієрархічний аналіз кластеризації 525 пухлин і 22 нормальних тканин поблизу пухлини з використанням кращих 3662 генів із варіабельною експресією (Додатковий мал. 5); за допомогою аналізу SigClust було ідентифіковано 12 класів (5 х класів з > 9 зразків на клас). Ми провели напівконтрольований ієрархічний кластерний аналіз з використанням раніше опублікованого «внутрішнього переліку гена» (14), за допомогою якого були ідентифіковані 13 класів (9 класів з > 9 зразків на клас) (Додатковий мал. 6). Ми також класифікували кожен зразок із використанням 50-генної моделі PAM50 (14) (Додатковий мал. 5). Висока узгодженість спостерігалася між усіма трьома аналізами, тому ми використовували визначений за допомогою PAM50 предиктор підтипу як загальну метрику класифікації. Було лише вісім нормальноподібних пухлин і вісім пухлин із низьким рівнем клаудину (27), тому ми не проводили фокусовані аналізи цих двох підтипів.

Рівні експресії мікроРНК були проаналізовані за допомогою секвенування «Illumina», використовуючи 1222 miRBase (28) v16 зрілі і «star strands» як довідкову базу даних транскриптів/генів мікроРНК. Було ідентифіковано сім підтипів на основі консенсусної кластеризації ненегативної матричної факторизації (NMF) з використанням висококопійної матриці, що містить 25% найбільш варіативних мікроРНК (306 транскриптів/генів або MIMAT (мікроРНК ID)). Ці підтипи корелювали з підтипами мРНК, ER, PR і клінічним статусом HER2 (Додатковий мал. 7). Слід зазначити, що групи 4 і 5 мікроРНК показали високе перекриття з мРНК базальноподібного підтипу і містили багато мутацій в гені TP53. Решта груп мікроРНК (1–3, 6 і 7) являла собою суміш підтипів «люмінальний А», «люмінальний B» і HER2E з незначною кореляцією з підтипами, визначеними PAM50. За винятком TP53, який показав сильну позитивну кореляцію, і PIK3CA і GATA3, які виявили негативну асоціацію з групами 4 і 5, кореляція зі статусом мутації і підтипом мікроРНК була незначною.

Метилювання ДНК

Масиви «Illumina Infinium» використовувалися для аналізу метилювання ДНК в 802 пухлинах молочної залози. Дані масивів HumanMethylation27 (HM27) і HumanMethylation450 (HM450) були об'єднані і профільтровані, що дало загальний набір із 574 зондів, що застосовувалися в неконтрольованому аналізі кластеризації, який ідентифікував п'ять різних груп метилювання ДНК (Додатковий мал. 8). Група 3 показала гіперметильований фенотип; вона була значно збагачена мРНК-підтипом «люмінальний В» і в ній були недостатньо представлені мутації PIK3CA, MAP3K1 і MAP2K4. Група 5 мала найнижчі рівні метилювання ДНК, перекривалася з базальноподібним підтипом мРНК і продемонструвала високу частоту мутацій TP53. HER2-позитивний (HER2+) клінічний статус, або підтип мРНК HER2E, виявив незначну асоціацію з підтипами метилювання.
Був проведений контрольований аналіз даних метилювання ДНК та експресії мРНК з метою порівняння метилювання ДНК в групі 3 (n = 49) з усіма пухлинами в групах 1, 2 і 4 (за винятком групи 5, яка складалася переважно з пухлин базальноподібного типу). Цей аналіз ідентифікував 4283 гени, які були диференційно метильовані (3735 були етильовані на більш високому рівні в групі 3), і 1899 генів, які диференційно експресуються (1232 пригнічуються); 490 генів були і метильованими, і з низькою експресією в групі 3 (Додаткова табл. 4). Для функціонального аналізу анотації була використана база даних для анотування, візуалізації та інтегрованого виявлення DAVID; за допомогою цього аналізу були ідентифіковані дані «частина позаклітинної області» і «сигнальний шлях Wnt», пов'язані з цим 490-генним набором; гіперметильовані зразки групи 3 показали менше мутацій PIK3CA і MAP3K1 і нижчу експресію генів Wnt-шляху.

Число копій ДНК

Загалом 773 пухлини молочної залози були проаналізовані з використанням масивів Affymetrix 6.0 SNP. Сегментаційний аналіз і GISTIC були залучені для визначення фокальних ампліфікацій/делецій і додаткових ділянок або втрат на рівні плеча хромосоми (Додаткова табл. 5). Ці аналізи підтвердили всі раніше зафіксовані варіації в кількості копій, і був виділений ряд значно мутованих генів, включаючи фокусну ампліфікацію ділянок, що містять PIK3CA, EGFR, FOXA1 і HER2, а також фокальних делецій ділянок, що містять MLL3, PTEN, RB1 і MAP2K4 (Додатковий мал. 9); у всіх випадках множинні гени були включені в кожній зміненій ділянці. Важливо зазначити, що багато з цих змін кількості копій корелюють з підтипом мРНК, включаючи характерну втрату 5q та посилення 10p у базальноподібних пухлинах (5,2 9) і додаткові ділянки 1q та/або втрату 16q у люмінальних пухлинах (4). NMF кластеризація сегментів GISTIC ідентифікувала п'ять кластерів/груп за кількістю копій, які корелюють з підтипом мРНК: Er, клінічний статус PR і HER2 та статус мутації TP53 (Додатковий мал. 10). Крім того, ця класифікація підтипу aCGH значно корелює з підтипами aCGH, недавно охарактеризованими в праці 30 (Додатковий мал. 11).

Масиви білків з оберненою фазою

Квантифікацію експресії 171 пов'язаних з раком білків і фосфопротеїнів за RPPA проводили на 403 пухлинах молочної залози (31). Аналіз методом неконтрольованої ієрархічної кластеризації ідентифікував сім підтипів; один клас містив дуже мало випадків для подальшого аналізу (Додатковий мал. 12.). Ці білкові підтипи були високо конкордатні з підтипами мРНК, особливо базальноподібним і HER2E. Докладніше вивчення визначеної RPPA підгрупи, що містить HER2, показало скоординовану надекспресію HER2 і EGFR із сильною конкодатністю з фосфорильованим HER2 (pY1248) і EGFR (pY992), ймовірно, через гетеродимеризацію і крос-фосфорилювання. Хоча є потенціал для незначної перехресної реактивності антитіл проти цих загальних пов'язаних та фосфобілків, конкордатність фосфорилювання HER2 і EGFR була підтверджена з використанням декількох незалежних антитіл.
У визначених за RPPA люмінальних пухлинах спостерігалася висока експресія білків ЕР, PR, AR, BCL2, GATA3 і INPP4B, які визначають, в основному, пухлини підтипу «люмінальний A», і другу, більш різнорідну, підгрупу білків, що притаманні пухлинам підтипів «люмінальний А» і «люмінальний B». Було ідентифіковано дві потенційно нові підгрупи, що вирізняються білками: група «реактивний I», що складалася головним чином з підмножини пухлин підтипу «люмінальний A», в той час як група «реактивний II» складала суміш підтипів мРНК. Ці групи називають «реактивними», тому що багато з характерних білків, включаючи фібронектин, кавеолін 1 і колаген VI типу, ймовірно, продукуються мікросередовищем і/або активованими раком фібробластами. Ці дві групи RPPA не мали помітної відмінності в процентному вмісті пухлинних клітин при зіставленні одна з одною або з іншими білковими підтипами, визначеними за допомогою аналізу масиву SNP або цитологічного дослідження. Крім того, контрольовані аналізи групи «реактивний І» при порівнянні з групою «реактивний II» з використанням аналізу експресії мікроРНК, метилювання ДНК, мутацій або даних про число копій ДНК не показали ніяких істотних відмінностей між цими групами, в той час як аналогічні контрольовані дослідження методами аналізу білка та експресії мРНК виявили багато відмінностей.

Мультиплатформне визначення підтипів

Щоб виявити структуру більш високого порядку в пухлинах молочної залози на основі даних декількох типів, значні кластери/підтипи від кожної з п'яти платформ були проаналізовані з використанням мультиплатформної матриці даних, підданій неконтрольованій консенсусній кластеризації (рис. 2). Такий підхід «кластер кластерів» (КК) показав, що базальноподібні пухлини мали найвиразніший мультиплатформний підпис, коли всі різні платформи для базальноподібних груп були об'єднані в один кластер. Чотири основні підгрупи КК добре корелюють з раніше опублікованими підтипами мРНК (що частково пояснюється тим, що чотири внутрішні підтипи були одним із вхідних елементів). У такий спосіб ми також провели КК-аналіз, в якому не були присутні дані мРНК (Додатковий мал. 13) або з 12 неконтрольованими підтипами мРНК (Додатковий мал. 14), і в кожному випадку були виділені 4-6 груп. У недавніх працях були ідентифіковані десять підгруп на основі кількості копій в наборі з 997 пухлин молочної залози (30). Ми оцінили цю класифікацію в КК-аналізі замість наших п'яти класів підтипів за числом копій або з PAM50 (Додатковий мал. 15), або 12 неконтрольованих підтипів мРНК (Додатковий мал. 16.); кожна з цих КК-класифікацій значною мірою корелювала з підтипами мРНК за PAM50 і з іншими КК-аналізами (мал. 2). Платформи профілювання транскрипції та RPPA продемонстрували високу кореляцію з консенсусною структурою, вказуючи на те, що зміст інформації аналізу числа копій аберацій, мікроРНК і метилювання реалізується на рівні експресії генів і функції білка.

image003

Малюнок 2. Координований аналіз підтипів раку молочної залози, визначених за допомогою п'яти різних геномних/протеомних платформ. а – Консенсусний кластерний аналіз підтипів ідентифікує чотири основні групи (зразки, n = 348). Синьо-біла теплова карта відображає консенсус зразків. b – Теплова карта підтипів, визначених незалежно за даними мікроРНК, метилювання ДНК, числа копій (CN), експресії PAM50 мРНК і експресії RPPA. Червона смуга вказує на належність до кластерного типу. с – Асоціації з молекулярними і клінічними особливостями. Значення P були розраховані з використанням тесту хі-квадрат.

Резюме аналізу люмінальний/ER+

Люмінальний/ER+ рак молочної залози є найбільш гетерогенним щодо експресії генів (Додатковий мал. 5), спектра мутацій (мал. 1), зміни кількості копій (Додатковий мал. 9) і результатів лікування (1, 14). Однією з найбільш домінантних рис є висока експресія мРНК і білка люмінального підпису (Додатковий мал. 5), який містить ESR1, GATA3, FOXA1, XBP1 і MYB; люмінальний/ER+ кластер також містив найбільшу кількість значно мутованих генів. Зокрема, GATA3 і FOXA1 мутували взаємовиключним чином, у той час як ESR1 і XBP1, як правило, мали значний рівень експресії, але мутували нечасто. Мутації в гені RUNX1 і його димеризаційному партнері – CBFB також, можливо, відіграють певну роль в аномальній сигналізації ЕР в люмінальних пухлинах, оскільки RUNX1 функціонує як ER «ДНК-зв'язувальний фактор» (32). Аналіз PARADIGM33, що порівнює люмінальний рак з базальноподібним, додатково підкреслив наявність гіперактивованого FOXA1-ER комплексу як критичного мережного хабу, що диференціює ці два підтипи пухлин (Додатковий мал. 17).

Це підтверджує факт високої частоти мутації PIK3CA в пухлинах молочної залози люмінального/ER+ підтипу (34,35). Застосовуючи різноманітні технологічні платформи, ми розглянули можливі зв'язки між мутацією PIK3CA і втратою PTEN, втратою INPP4B та множинними підписами активності шляху експресії гена і білка. Дані RPPA показали, що pAKT, pS6 і p4EBP1, які є типовими маркерами активації шляху фосфатидилінозит-3-ОН-кінази (PI(3)K), не були підвищені в PIK3CA-мутованих пухлинах підтипу «люмінальний А»; натомість вони були сильно експресовані в базальноподібному і HER2E підтипах мРНК (останній має часті мутації PIK3CA) і значно корелювали з втратою INPP4B і PTEN, а також, до певної міри, – з ампліфікацією PIK3CA. Аналогічним чином підписи білка (36) і трьох мРНК (37–39) активації шляху (PI(3)K) були збагачені в пухлинах базальноподібного підтипу порівняно з «люмінальним A» підтипом (мал. 3). Ця явна невідповідність між наявністю мутацій у PIK3CA і біомаркерах активації шляху вже відзначалася раніше (36).

Іншим яскравим результатом досліджень люмінального/ER+ підтипу були часті мутації MAP3K1 і MAP2K4, які являють собою два суміжних кроки в рамках шляху р38-JNK1 (24, 40). Передбачають, що ці мутації є інактивуючими, причому MAP2K4 також виступає мішенню фокальної втрати ДНК в люмінальних пухлинах (Додатковий мал. 9). Для вивчення можливої взаємодії між PIK3CA, MAP3K та сигналізацією MAP2K4 було проведено MEMo аналіз (41) з метою ідентифікувати взаємовиключні зміни, які мають за мішень часто змінювані гени, що, ймовірно, належать до одного і того самого шляху (мал. 4). У всіх випадках раку молочної залози MEMo аналіз дозволяв ідентифікувати набір модулів, які підкреслюють диференціальні явища активації всередині шляху рецептора тирозинкінази (РТК)-PI(3)K (мал. 4а); мутації PIK3CA були дуже поширені при люмінальному/ER+ раку, тоді як втрата PTEN була більш поширена в базальноклітинних пухлинах. Майже всі мутації MAP3K1 і MAP2K4 були в люмінальних пухлинах, але MAP3K1 і MAP2K4 були майже взаємовиключними. Шлях TP53 був диференційно інактивованим у пухлинах молочної залози люмінального/ER+ підтипу, відзначався низькою частотою мутацій TP53 в пухлинах підтипу «люмінальний А» (12%) і більш високою частотою – у пухлинах підтипу «люмінальний B (29%) (мал. 1). На додаток до безпосередньо TP53 мала місце ціла низка інших інактивуючих явищ, серед них втрата ATM і ампліфікація MDM2 (мал. 3b та 4b), обидва ці явища частіше відбувалися в пухлинах підтипу «люмінальний B». Аналіз експресії генів показав, що окремі маркери підписів функціональної активності TP53 (GADD45A і CDKN1A) і TP53 (42, 43) були найвищими в пухлинах підтипу «люмінальний А» (мал. 3б). Ці дані показують, що шлях TP53 залишається майже незмінним у пухлинах підтипу «люмінальний А», але часто інактивується в більш агресивних видах раку підтипу «люмінальний B» (44). Інші відмінності в шляхах, виявлені за допомогою аналізу PARADIGM, що визначають належність пухлини до підтипу «люмінальний B» проти підтипу «люмінальний А», включали гіперактивацію транскрипційної активності, пов'язаної з MYC, і проліферацію FOXM1.

Критичний шлях ретинобластома/RB1 також показав альтерації, специфічні в залежності від підтипу мРНК (мал. 3в). Безпосередньо RB1, ідентифікований за експресією мРНК і білка, був виявлений у більшості люмінальних пухлин, при цьому рівні були найвищими в межах підтипу «люмінальний А». Частим явищем на рівні онкогенів була ампліфікація і високий рівень експресії цикліну D1, що переважно траплялося в люмінальних пухлинах, а конкретніше – в межах підтипу «люмінальний B». На відміну від цього, можливий супресор пухлин CDKN2C (також званий p18) був на найнижчому рівні в пухлинах підтипу «люмінальний А», що узгоджується із спостереженнями на мишачих моделях (45). Нарешті, підписи активності RB1 були також високими в люмінальних пухлинах (46-48). Пухлини підтипу «люмінальний A», які мають кращий прогноз, найімовірніше, зберігають активність основних пухлинних супресорів RB1 і TP53.

Ці геномні характеристики дали ключі для визначення мішеней, що піддаються дії ліків. Ми склали таблицю мішеней для ліків, де визначили мішень як ген/білок, для якого існує зареєстрований або досліджуваний у клінічних випробуваннях на людях лікарський засіб, націлений на певну молекулу або канонічний сигнальний шлях (Додаткова табл. 6). У раках пухлин підтипу люмінальний/ER+ висока частота мутацій PIK3CA вказує на те, що інгібітори цієї активованої кінази або її сигнального шляху можуть бути корисними. Інші потенційні мішені для ліків – значно мутовані гени – включають інгібітори AKT1 (11 з 12 варіантів AKT1 були люмінальними) та інгібітори PARP для мутацій BRCA1/BRCA2. Хоча вони досі не були схвалені як біомаркери, нині ідентифіковано багато потенційних мішеней для ліків на основі числа копій, серед них ампліфікації рецепторів факторів росту фібробластів (FGFR) і IGFR1, а також циклін D1, CDK4 і CDK6. Стислий опис загальних висновків щодо люмінальних пухлин та інших підтипів представлений в таблиці 1.

Класифікації на основі HER2 та стислий аналіз

Ампліфікація ДНК в HER2 добре фіксувалася в цьому дослідженні (Додатковий мал. 9). Те саме стосується надлишкової експресії множинних HER2-амплікон-асоційованих генів, які почасти визначають підтип HER2E мРНК (Додатковий мал. 5). Однак не всі клінічно HER2+ пухлини належать до підтипу HER2E мРНК і не всі пухлини підтипу HER2E мРНК є клінічно HER2+. Інтегрований аналіз даних RPPA і мРНК чітко окреслив групу HER2+ (Додатковий мал. 12). Коли підтипи білка HER2+ і мРНК HER2E перекривалися, спостерігався сильний сигнал EGFR, pEGFR, HER2 і pHER2. Однак тільки 50% клінічно HER2+ пухлин потрапляють у цю групу HER2E-мРНК-підтипу/HER2-білка, решта клінічно HER2+ пухлин спостерігаються переважно в люмінальному підтипі за мРНК.

Ці дані показують, що існують принаймні два типи клінічно визначених HER2+ пухлин. Для виявлення відмінностей між цими групами був проведений контрольований аналіз експресії генів, в якому порівнювали 36 пухлин підтипу HER2E-мРНК/HER2+ з 31 підтипами люмінального-мРНК/HER2+. Було ідентифіковано 302 гени, що експресуються по-різному (q-значення = 0%) (Додатковий мал. 18 та Додаткова табл. 7). Ці гени значною мірою відобразили стан ER, але також вказали на те, що пухлини підтипу HER2E-мРНК/HER2+ показали значно вищу експресію цілої низки RTK, у тому числі FGFR4, EGFR, безпосередньо HER2, а також генів у ампліконі HER2 (у тому числі GRB7). З іншого боку, пухлини підтипу люмінальний-мРНК/HER2+ показали більш високу експресію генів люмінального кластера, включаючи GATA3, BCL2 і ESR1. Подальше підтвердження наявності двох типів клінічно визначеної HER2+ пухлини було отримано на основі даних про соматичні мутації, контрольовані або підтипом мРНК, або статусом ER; мутації TP53 були значно підвищені в HER2E та ER-негативних пухлинах, тоді як мутації GATA3 спостерігалися тільки в люмінальних підтипах або в пухлинах ER+.
Аналіз даних RPPA з урахуванням підтипу мРНК ідентифікував 36 білків із відмінністю в експресії (q-значення < 5%) (Додатковий мал. 18g і Додаткова таблиця 8). Сигнал EGFR/pEGFR/HER2 pHER2 знову спостерігався і був присутнім у пухлинах підтипу HER2E-мРНК/HER2+, у них же була підвищена експресія pSRC та pS6 і, навпаки, багато білкових маркерів люмінального раку знову вирізняли пухлини підтипу люмінальний-мРНК/HER2. Враховуючи важливість клінічного статусу HER2, чітко спрямований аналіз був проведений на основі RPPA-визначеної експресії білка при HER2 (Додатковий мал. 19); результати повністю узгоджуються з висновками відносно генів амплікону RPPA щодо експресії мРНК, а підпис RPPA EGFR/pEGFR/HER2/pHER2, в кінцевому підсумку, ідентифікує принаймні дві групи/підтипи в клінічно HER2+ пухлинах (табл. 1). Ці підписи представляють біомаркер(и) раку молочної залози, які потенційно можуть прогнозувати відповідь на таргетну терапію проти раку HER2.

Багато терапевтичних успіхів пов'язані із захворюванням, що клінічно проявляється як HER2+. Це дослідження виявило додаткові соматичні мутації, які представляють потенційні терапевтичні мішені в рамках цієї групи, у тому числі високу частоту мутацій PIK3CA (39%), більш низьку частоту мутацій PTEN і PIK3R1 (Додаткова таблиця 6) і геномні втрати PTEN і INPP4B. Інші можливі мутації, що можуть бути мішенями для ліків, охоплюють варіанти в межах членів сімейства HER, включаючи дві соматичні мутації в HER2, дві в EGFR і п'ять у HER3. Мішенню пертузумабу в комбінації з трастузумабом є гетеродимер HER2-HER3 (49), проте ці дані вказують на те, що націлювання на EGFR з HER2 також може бути корисним. Нарешті, підтип мРНК HER2E звичайно покувазав високу анеуплоїдію, найвищу частоту соматичних мутацій (табл. 1) і ампліфікації ДНК інших потенційних терапевтичних мішеней, у тому числі FGFR, EGFR, CDK4 і цикліну D1.

image005

Малюнок 3. Комплексний аналіз шляхів PI(3)K, TP53 і RB1. Підтипи раку молочної залози відрізняються явищами, мішенями яких є гени і геном, з відповідним впливом на активність сигнального шляху. a–c: для сигнальних шляхів PI(3)K (а), TP53 (b) і RB1 (c) ключові гени були обрані, виходячи з попередніх біологічних знань. Були визначені кілька підписів експресії мРНК для даного шляху (подробиці див. «Додаткові методи»; PI(3)K: Saal, втрата PTEN у пухлинах молочної залози людини; CMap, PI(3)K/mTOR інгібітор in vitro; Majumder, надлишкова експресія Akt в моделі миші; TP53: МАІР, експерт-кураторні мішені p53; GSK, мутант TP53 проти клітинних ліній дикого типу; Kannan, надлишкова експресія TP53 in vitro; TROESTER, нокдаун TP53 in vitro; RB: CHICAS, RB1 мишачий нокаут проти дикого типу; LARA, RB1 нокдаун in vitro; HERSCHKOWITZ, втрата гетерозиготності (LOH) RB1 у пухлинах молочної залози людини) і застосовувалися до даних експресії гена, щоб оцінити кожну пухлину на предмет відносної активності підпису (жовтий – більш активний). Панель PI(3)K включає в себе білковий (RPPA) протеомний підпис. Пухлини були впорядковані таким чином, що спочатку розглядалися підтипи за мРНК, хоча конкретний алгоритм впорядкування відрізняється між панелями. Значення P були розраховані методом кореляції Пірсона або за допомогою критерію хі-квадрат.

Стислий аналіз даних по базальноподібному раку

Базальноподібний підтип було виявлено понад десять років тому за допомогою мікрочипів кДНК першого покоління (13). Ці пухлини часто називають потрійним негативним раком молочної залози (TNBC), тому що більшість базальноподібних пухлин, як правило, є негативними за ER, PR і HER2.

image007

Малюнок 4. Аналіз взаємовиключних модулів при раку (MEMo). Взаємовиключні модулі представлені їхніми генними компонентами і з'єднані, щоб відобразити їхню активність у різних сигнальних шляхах. Для кожного гена наведена частота альтерацій при базальноподібному (праве поле) і небазальноподібному (ліве поле) підтипах. Поруч з кожним модулем показано відбиток пальців, що вказує на те, що спостерігається специфічна альтерація для кожного гена (рядки) в кожному зразку (стовпчики). а – аналіз MEMo ідентифікував кілька модулів, що перекриваються, які узагальнюють сигнальні шляхи RTK–PI(3)K і p38-JNK1 і в яких основним був модуль з найвищим балом. b – аналіз MEMo ідентифікував альтерації в сигналізації TP53 як такі, що зустрічаються в рамках статистично значущої взаємовиключної тенденції. с – аналіз MEMo лише базальноподібного раку ідентифікував один модуль, який включав мутації ATM, дефекти у BRCA1 і BRCA2 і дерегулювання шляху RB1. Теплова карта експресії гена наведена нижче відбитків пальців для показу рівнів експресії.

Проте прибл. 75% TNBC є базальноподібними, а решта 25% складається з усіх інших підтипів мРНК (6). У цьому наборі даних спостерігався високий ступінь перекриття між цими двома відмінностями: 76 TNBC, 81 базальноподібні і 65, які були і TNBC, і базальноподібні. Враховуючи відому неоднорідність TNBC і те, що базальноподібний підтип, як було доведено, відрізняється на кожній платформі, ми вирішили використати базальноподібні розбіжності для порівняльного аналізу.

Базальноподібні пухлини показали високу частоту мутацій TP53 (80%) (9), що в поєднанні з визначеною активністю шляху TP53, вказує на те, що втрата функції TP53 має місце в більшості, якщо не в усіх, випадках базальноподібного раку (мал. 3б). На додаток до втрати TP53, аналіз MEMo підтвердив, що базальноподібному підтипу властиві втрати RB1 і BRCA1 (мал. 4в) (47,50). Ген PIK3CA посів друге місце за кількістю мутацій (близько 9%), проте визначена активність шляху PI(3)K, чи то на підставі даних про ген (37–39), чи про білок (36), чи про високу активність шляху PI(3)K/AKT, була найвищою при базальноподібному раку (мал. 3а). Альтернативні способи активації PI(3)K шляху при базальноподібному раку, ймовірно, включають втрати PTEN і INPP4B та/або ампліфікацію PIK3CA. У недавно опублікованій праці (12) було виконано секвенування екзому в 102 TNBC. П'ять із шести найчастіших мутацій при TNBC, описані у праці 12, спостерігалися також з однаковою частотою в нашій підмножині TNBC (Myo3A, в цій праці не представлено); зі згаданих п'яти три пройшли наш тест як значно мутований ген у TNBC (Додаткова табл. 2).

Особливості експресії базальноподібних пухлин включають характерний підпис, що містить кератини 5, 6 і 17 і високу експресію генів, асоційованих із проліферацією клітин (Додатковий мал. 5). Аналіз PARADIGM (33), в якому базальноподібні пухлини порівнювалися з люмінальними, підкреслив важливість гіперактивації FOXM1 як драйвера транскрипції цього посиленого підпису проліферації (Додатковий мал. 17). Аналіз PARADIGM також ідентифікував гіперактивовані мережні хаби MYC і HIF1a/ARNT як ключові регуляторні особливості базальноподібного раку. Незважаючи на те, що ділянка хромосоми 8q24 є ампліфікованою в усіх підтипах (Додатковий мал. 9), висока активація MYC видається характерною ознакою саме базальноподібного підтипу (51).

Враховуючи разючі контрасти між базальноподібним і люмінальним/HER2E підтипами, ми провели аналіз MEMo на взятих окремо базальноподібних пухлинах. Модуль топ-скорингу включає мутації ATM, інактивацію BRCA1 і BRCA2, втрату RB1 і ампліфікацію цикліну Е1 (мал. 4с). Слід зазначити, що ці самі модулі були ідентифіковані раніше для серозного раку яєчників (41). Крім того, спектри базальноподібних (і TNBC) мутацій нагадують спектр, що спостерігається при серозному раку яєчників (52) тільки з одним геном (тобто TP53) при частоті мутацій > 10%. Щоб вивчити можливі подібності між серозним раком яєчників і базальноподібним раком молочної залози, ми провели ряд аналізів, порівнюючи рак яєчників із люмінальним раком молочної залози, рак яєчників із базальноподібним раком молочної залози і базальноподібний рак молочної залози з люмінальним раком молочної залози (мал. 5).

Порівнюючи характеристики кількості копій, ми спостерігали кілька спільних рис між раком яєчників і базальноподібним раком молочної залози, включаючи поширену геномну нестабільність, однакові додаткові елементи в 1q, 3q, 8q і 12p і втрати в 4q, 5q і 8p (Додатковий мал. 20A). Вдаючись до більш глобального порівняння числа копій, ми розглянули загальну частку зміненого геному і кореляцію між сумарною кількістю копій при раку яєчників порівняно з раком молочної залози за кожним підтипом мРНК (Додатковий мал. 20А, Б.). В обох випадках базальноподібні пухлини були найбільш близькими до серозних пухлин яєчника.

Ми систематично шукали інші спільні риси між серозним раком яєчників і базальноподібним раком молочної залози, і кожен із них порівнювали з люмінальним підтипом. Ми ідентифікували: (1) інактивацію BRCA1; (2) втрату RB1 і ампліфікацію цикліну E1; (3) високу експресію AKT3; (4) ампліфікацію і високий рівень експресії MYC та (5) високу частоту мутацій TP53 (мал. 5а). Був виконаний додатковий контрольований аналіз великого зовнішнього транскриптомного набору даних мультитуморного типу (Gene Expression Omnibus accession GSE2109), в ході якого профіль експресії кожної пухлини молочної залози TCGA (Атлас геному раку) порівнювали за допомогою кореляційного аналізу з таким кожної пухлини в мультитуморному наборі.

Базальноподібні пухлини молочної залози чітко показали високу кореляцію експресії мРНК із серозним раком яєчників, а також із плоскоклітинним раком легень (мал. 5b). Був виконаний аналіз PARADIGM, що дозволяє розрахувати, чи активується диференційно особливість гена або сигнального шляху в базальноподібній пухлині порівняно з люмінальним раком і чи характерна більш висока загальна активність для зразків TCGA яєчників. За допомогою цього аналізу була ідентифікована порівняно висока активність регуляторних хабів шляху HIF1-α/ARNT, MYC і FOXM1 як у пухлинах яєчників, так і в базальноподібних пухлинах молочної залози (Додатковий мал. 20с). Виявлені спільні характеристики: втрати TP53, RB1 і BRCA1 при ампліфікації MYC переконливо показують, що вони є рушійною силою як для базальноподібного раку молочної залози, так і серозного раку яєчників.
Це говорить на користь того, що потрібно розглядати загальні терапевтичні підходи, про що свідчить і активність аналогів платини і таксанів при базальноподібному раку молочної залози та серозному раку яєчників.

Таблиця 1. Основні геномнi, клінічнi та протеомнi особливостi підтипів

Підтип

Люмінальний A

Люмінальний В

Базальноподібний

HER2E

ER+/HER2- (%)

87

82

10

20

HER2+ (%)

7

15

2

68

TNBC (%)

2

1

80

9

Шлях TP53

Мут TP53 (12%); додатковий елемент MDM2 (14%)

Мут TP53 (32%); додатковий елемент MDM2 (31%)

Мут TP53 (84%); додатковий елемент MDM2 (14%)

Мут TP53 (75%); додатковий елемент MDM2 (30%)

Шлях PIK3CA/PTEN

Мут PIK3CA (49%); Мут/втрата PTEN (13%);втрата INPP4B (9%)

Мут PIK3CA (32%) Мут/втрата PTEN (24%) втрата INPP4B (16%)

Мут PIK3CA (7%); Мут/втрата PTEN (35%); втрата INPP4B (30%)

Мут PIK3CA (42%); Мут/втрата PTEN (19%); втрата INPP4B (30%)

Шлях RBI

Амп циклін D1 (29%);додатковий елемент CDK4(14%); низька експресія CDKN2C; висока експресія RBI

Амп циклін D1 (58%);додатковий елемент CDK4(25%)

RBI mut/loss (20%); амп циклін El (9%); висока експресія CDKN2A; низька експресія RBI

Амп циклін D1 (38%); додатковий елемент CDK4(24%)

Експресія мРНК

Високий ER кластер; низька проліферація

Більш низький ER кластер; висока проліферація

Базальний підпис; висока проліферація

Підпис HER2 амплікону; висока проліферація

Копійність

Переважно диплоїдія; багато з тихими геномами; lq, 8q, 8pl 1 gain; 8p, 16q втрата; 1 lql3.3 амп (24%)

Переважно анеуплоїдія; багато мають фокальну амп; додатковий елемент lq, 8q, 8pl 1; втрата 8p, 16q; амп llq 13.3 (51%); амп 8p 11.23 (28%)

Переважно анеуплоїдія; висока нестабільність геному; додатковий елемент lq, 10р; втрата 8p, 5q;фокальний додатковий елемент у MYC (40%)

Переважно анеуплоїдія; висока нестабільність геному; додатковий елемент lq, 8q; втрата 8p; 17ql2 фокальна амп ERRB2 (71%)

Мутації ДНК

PIK3CA (49%); TP53 (12%); GATA3 (14%); MAP3K1 (14%)

TP53 (32%); PIK3CA (32%); MAP3K1 (5%)

TP53 (84%); PIK3CA (7%)

TP53 (75%); PIK3CA (42%); PIK3R1 (8%)

Метулювання ДНК

-

Гіперметульований фенотип для піднабору

Гіпометильований

-

Експресія білка

Висока сигналізація естрогену; висока експресія MYB; RPPA реактивні підтипи

Менш висока сигналізація естрогену; висока експресія FOXM1 і MYC; RPPA реактивні підтипи

Висока експресія білків репарації ДНК, підпис втрати PTEN і INPP4B (pAKT)

Висока експресія білка та фосфопротеїну EGFR і HER2

Проценти вираховані на підставі даних по 466 пухлинах списку перекриття. Амп — ампліфікація; мут — мутація.

Враховуючи те, що в більшості випадків базальноподібні пухлини є TNBC, пошук нових мішеней для препаратів для лікування цієї групи захворювань є критично важливим. На жаль, репертуар соматичних мутацій при базальноподібному раку молочної залози не надав загальної мішені, за винятком BRCA1 і BRCA2. Тут ми зазначимо, що 20% базальноподібних пухлин мали генеративні (n = 12) та/або соматичні (n = 8) варіанти BRCA1 або BRCA2, що вказує на те, що один з п'яти хворих на базальноподібний рак може отримати користь від застосування інгібіторів PARP і/або сполук платини (53,54).

Копійність при базальноподібному раку показала множинні ампліфікації та делеції, частина з яких може слугувати терапевтичними мішенями (Додаткова табл. 6). Потенційні цілі включають втрати PTEN і INPP4B, обидва з яких, як було показано, сенсибілізують клітинні лінії до інгібіторів шляху PI(3)K (55,56). Цікаво, що багато з компонентів шляху PI(3)K і RAS-RAF-MEK мали ампліфікації (але зазвичай не мутації) в базальноподібних пухлинах, включаючи PIK3CA (49%), KRAS (32%), BRAF (30%) і EGFR (23%). Інші RTK, які можуть слугувати мішенями для ліків і мають ампліфікації в деяких базальноподібних пухлинах, включають FGFR1, FGFR2, IGFR1, KIT, MET і PDGFRA. Нарешті, за допомогою аналізу PARADIGM була ідентифікована висока активність шляху HIF1-α/ARNT, що вказує на те, що ці злоякісні пухлини можуть бути сприйнятливими до інгібіторів ангіогенезу та/або біоредуктивних препаратів, які активуються в умовах гіпоксії.

image009

Малюнок 5. Порівняння карцином молочної залози і серозних пухлин яєчника: а – Істотно збагачені геномні альтерації, ідентифіковані при порівнянні базальноподібного раку молочної залози або серозних пухлин яєчників з люмінальним раком. b – міжвибіркові кореляції (жовтим кольором позначена позитивна кореляція) між профілями транскрипції генів у пухлинах молочної залози (стовпчики: дані TCGA, згруповані за підтипом) та профілями раку, що походить із різних тканин (рядки: зовнішній набір даних «TGEN expO», GSE2109), в тому числі раку яєчників.

Заключні зауваження

Інтегровані молекулярні аналізи раку молочної залози, про результати яких ми повідомляємо в цій статті, значно розширюють наші знання, дозволяючи створити всебічний каталог імовірних геномних драйверів найбільш поширених підтипів раку молочної залози (табл. 1). Наші інноваційні спостереження, що вказують на те, що різні генетичні та епігенетичні альтерації сходяться фенотипічно в чотири основні класи раку молочної залози, узгоджуються не тільки з концепцією конвергентної еволюції генних схем, як видно з аналізу різних організмів, а й з моделями клональної експансії раку молочної залози і селекції клітин in vivo, запропоновані задля пояснення фенотипічної гетерогенності, що спостерігається при певних підтипах раку молочної залози.

Резюме методів

Зразки були отримані у пацієнтів з відповідної згоди, наданої етичними комітетами. ДНК і РНК очищали із застосуванням протоколу коізоляції. Загалом 800 хворих аналізували на щонайменше одній платформі. Для кожної платформи була використана різна кількість пацієнтів, при цьому використовувалась найбільша кількість пацієнтів, доступних на момент заморожування даних; 466 зразків (463 хворих) використовувалися спільно на 5 з 6 платформ (за винятком RPPA) і 348 пацієнтів – на 6 з 6 платформ. Технологічні платформи, що залучалися, включають: (1) мікрочипи ДНК для вивчення експресії генів (52), (2) масиви метилювання ДНК, (3) секвенування мікроРНК, (4) масиви Affymetrix SNP, (5) секвенування екзомів і (6) масиви з оберненою фазою білка. Кожна платформа, за винятком секвенування екзомів, була використана в аналізі de novo для ідентифікації підтипів (див. «Додаткові методи»), а потім включена в єдиний аналіз для визначення загальної архітектури підтипу. Були виконані додаткові інтегровані, спільні для всіх платформ, обчислювальні аналізи, в тому числі PARADIGM (33) і MEMo (41).

iepor pdf

Останнє редагування Вівторок, 08 липня 2014 08:37
Ви тут: Home Функціональна геноміка РГЗ Комплексні молекулярні портрети пухлин грудної залози людини